HELMGTON JOSÉ BRITO DE SOUZA S U B S T I T U I Ç Ã O D O T R O N C O D A A RT É R I A PULMONAR EM CARNEIROS, UTILIZANDO H E T E R O E N X E R T O T U B U L A R VA LVA D O , PRESERVADO EM L-HydroR Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Ciências São Paulo 2011 HELMGTON JOSÉ BRITO DE SOUZA S U B S T I T U I Ç Ã O D O T R O N C O D A A RT É R I A PULMONAR EM CARNEIROS, UTILIZANDO H E T E R O E N X E R T O T U B U L A R VA LVA D O , PRESERVADO EM L-HydroR Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Ciências Orientador: Prof. Dr. Ênio Buffolo Co-Orientadores: Prof. Dr. José Honório de Almeida Palma Dr. Diego Felipe Gaia dos Santos São Paulo 2011 i Souza, Helmgton José Brito de. Substituição do tronco da artéria pulmonar em carneiros, utilizando heteroenxerto tubular valvado, preservado em L-HydroR./Helmgton José Brito de Souza. -- São Paulo, 2011. xvii,118f. Tese (Doutorado) - Universidade Federal de São Paulo. Programa de Pós Graduação em Cirurgia Plástica, com ênfase em Cirurgia Cardiovascular Título em inglês: Replacing the body of pulmonary artery in sheep using tubular graft valved bovine pericardium with non aldehydic preservation. 1. Bioprótese 2. Valvas 3. Cirurgia Cardíaca 4. Polietilenoglicol 5. Glutaraldeído ii UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM CIRURGIA PLÁSTICA, COM ÊNFASE EM CIRURGIA CARDIOVASCULAR COORDENADOR: Prof. Dr. MIGUEL SABINO NETO iii Dedicatória Ao meu pai, Hélio, exemplo de honradez e dignidade; À minha mãe, Mamédia, que, através do seu AMOR mostrou-me o caminho da vitória com determinação e perseverança; À Estrella da minha Vida, Lu, que me ensinou o real sentido da palavra AMAR; À nossa pequenina Estrella, Bia, que nos ensina quão simples, natural e sincero é dizer - EU TE AMO. iv Agradecimentos Ao Prof. Dr. ÊNIO BUFFOLO, meu orientador, PROFESSOR TITULAR DA DISCIPLINA DE CIRURGIA CARDIOVASCULAR DA ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA - UNIFESP, exemplo de liderança, firmeza e sabedoria, responsável pela formação e aperfeiçoamento de uma legião de cirurgiões espalhados pelo país, cujo nome e legado já figuram dentre os principais mestres do nosso tempo. Ao Prof. Dr. JOSÉ HONÓRIO DE ALMEIDA PALMA DA FONSECA, PROFESSOR ADJUNTO DA DISCIPLINA DE CIRURGIA CARDIOVASCULAR DA ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA UNIFESP, exemplo de inventividade e dedicação, meu sincero agradecimento pelo privilégio de conviver e aprender com seu carisma, habilidade, experiência e humildade. Ao Prof. Dr. IVAN SÉRGIO JOVIANO CASAGRANDE, exemplo de perseverança, pioneirismo e espírito científico, cujo apoio foi essencial para a realização deste estudo no Centro de Pesquisas da LABCOR - Minas Gerais. Aos amigos JORGE FERREIRA, RUBEM JUNQUEIRA e KLEUDER LEÃO, que incentivaram e viabilizaram a realização deste projeto. Às sempre colaboradoras LAILA OLIVEIRA e DANIELA LACERDA, bem como os ex-membros da minha equipe cirúrgica, RILSON MOITINHO, MARILENE PINHEIRO e JEANE FORTUNA, pela compreensão nos momentos de ausência. Meus sinceros agradecimentos. v À equipe do Centro de Pesquisas da LABCOR: PATRÍCIA DODD veterinária, aos técnicos MARISA e LEANDRO e aos colaboradores BEATRIZ e VADI, pelo exemplo de profissionalismo durante o período de realização do estudo. Aos amigos da Disciplina de Cirurgia Cardiovascular da UNIFESP Escola Paulista de Medicina, residentes, instrumentadores e perfusionistas, demais profissionais técnicos e administrativos, pela receptividade e hospitalidade no período de participação nas atividades da disciplina. Aos professores da Disciplina de Cirurgia Cardiovascular da UNIFESP Escola Paulista de Medicina: Prof. Dr. ROBERTO CATANI, Prof. Dr. JOÃO NELSON RODRIGUES BRANCO, Prof. Dr. MIGUEL MALUF, Prof. Dr. WALTER GOMES, Dr. CARLOS TELES, Dr. DIEGO GAIA, pelo apoio e contribuição no período de convívio nas atividades da disciplina. Aos Drs. NELSON AMERICO HOSSNE JUNIOR e HEITOR FRANCISCO DE CARVALHO GOMES pelas cuidadosas e valorosas contribuições feitas no texto dessa tese, assim como na apresentação. Ao Dr. SÉRGIO CAMPO CHRISTO, pelo apoio na realização dos procedimentos cirúrgicos. Ao Dr. LUÍZ SÉRGIO ALVES-SILVA, pela criteriosa e caprichosa análise estatística dos dados desta tese. vi Ao Dr. MARCO ANTÔNIO CARDOSO DE ALMEIDA, pela contribuição inestimável na reavaliação do estudo anátomo-patológico. À equipe técnica do CEPED: HELENA ALVES, GEÍSA MELO, DJAVÃ MARTINS, BÁRBARA ARAÚJO, RITA DE CASSIA DANTAS, pela operacionalização da técnica de dosagem de cálcio por absorção atômica. À Profa. ELZA SANTOS SILVA, pelo carinho na avaliação e correção ortográfica e gramatical desta tese. Aos colegas e companheiros da CARDIOTÓRAX, COOPERATIVA DOS CIRURGIÕES CARDIOVASCULARES E TORÁCICOS DO ESTADO DA BAHIA, pelo estímulo à defesa profissional, pelo exemplo de união, maturidade e compromisso com a ética e o exercício digno da “ARTE DE CURAR”. Aos médicos, abaixo nomeados, que, cronologicamente, desde os primeiros anos de academia, na permanente busca pelo saber, contribuiram para minha formação e desenvolvimento profissional: ÁLVARO FERNANDO SILVA, MARCELO DANILLO DA COSTA LAGO, SEBASTIÃO HELDENIR DE MESQUITA JÚNIOR, PAULO FERNANDO DA GLÓRIA LEAL, LUCIANO ESPINHEIRA FONSECA JÚNIOR, JOSÉ SIQUEIRA, WELLINGTON FREITAS, ANIBAL SILVANY FILHO, GERALDO MILTON DA SILVEIRA, SÉRGIO MIES, ANDRÉ BEAR JÚNIOR, GUILHERME SCHETTINO, JOÃO PLÍNIO DE SOUZA, PAULO MASSAROLO, JOSÉ ANTÔNIO DE ALMEIDA SOUZA, ALBINO EDUARDO NOVAES, HEONIR DE JESUS P. ROCHA, RODOLFO DOS SANTOS TEIXEIRA, EUVALDO ROSA, ANTÔNIO JOSÉ DE SOUZA MACHADO, EDIRIOMAR PEIXOTO , RICARDO ELOY PEREIRA , NADJA vii KRAYCHETE, RICARDO BARROS CORSO, LAUDELINO SOUSA FILHO, MARCOS LUCIANO PARREIRA GOULART , NILZO AUGUSTO M. RIBEIRO, JORGE PEREIRA, LÍCIA CAVALCANTE, OTÁVIO MARAMBAIA, CELSO FIGUEROA, RICARDO FERRAZ, A N D R É N E Y M . F R E I R E , I VA N S É R G I O J O V I A N O CASAGRANDE, ÊNIO BUFFOLO, JOSÉ HONÓRIO DE ALMEIDA PALMA. viii EPÍGRAFE Viva! Bom mesmo é ir à luta com determinação, abraçar a vida com paixão, perder com classe e vencer com ousadia, porque o mundo pertence a quem se atreve e a vida é "muito" pra ser insignificante. Já perdoei erros quase imperdoáveis, tentei substituir pessoas insubstituíveis e esquecer pessoas inesquecíveis. Já fiz coisas por impulso, já me decepcionei com pessoas quando nunca pensei me decepcionar, mas também decepcionei alguém. Já abracei pra proteger, já dei risada quando não podia, fiz amigos eternos, amei e fui amado, mas também já fui rejeitado, fui amado e não amei. Já gritei e pulei de tanta felicidade, já vivi de amor e fiz juras eternas, "quebrei a cara muitas vezes"! Já chorei, ouvindo música e vendo fotos, já liguei só para escutar uma voz, me apaixonei por um sorriso, já pensei que fosse morrer de tanta saudade e tive medo de perder alguém especial (e acabei perdendo). Mas vivi, e ainda vivo! Não passo pela vida… E você também não deveria passar! Charles Chaplin ix SUMÁRIO Dedicatória ......................................................................... iv Agradecimentos ................................................................. v Epígrafe .............................................................................. ix Listas .................................................................................. xi Resumo ............................................................................... xvii 1. Introdução ...................................................................... 1 2. Objetivos ........................................................................ 17 3. Métodos .......................................................................... 19 4. Resultados ...................................................................... 42 5. Discussão ........................................................................ 70 6. Conclusões ...................................................................... 78 7. Referências ..................................................................... 80 8. Normas adotadas ........................................................... 100 9. Abstract .......................................................................... 102 10. Anexos .......................................................................... 103 Lista de Figuras FIGURA 1: Tubo valvado de pericárdio bovino, com cúspides de pericárdio porcino, preservado em L-HydroR...... FIGURA 2: Aspecto cirúrgico final pós cirurgia de implante de prótese (Grupos L-HydroR e Glutaraldeído) ............ FIGURA 3: Verificação hemodinâmica (pós implante e antes do sacrifício) ........................................................... FIGURA 4: PMVD - Grupos L-HydroR e Glutaraldeído (pós implante) .................................................................. FIGURA 5: PMAP - Grupos L-HydroR e Glutaraldeído (pós implante) .................................................................. FIGURA 6: Gradiente (VD-AP) - Grupos L-HydroR e Glutaraldeído (pós implante) ................................... 14 44 45 46 46 47 FIGURA 7: PSAP1 X PSAP2 - Grupo L-HydroR ........................ 47 FIGURA 8: PSAP1 X PSAP2 - Grupo Glutaraldeído .................. 48 FIGURA 9: PMVD1 X PMVD2 - Grupo L-HydroR .................... 48 FIGURA 10: PMVD1 X PMVD2 - Grupo Glutaraldeído .............. 49 FIGURA 11: Gradiente VD-AP1 X Gradiente VD-AP2 - Grupo L-HydroR .................................................................. FIGURA 12: Gradiente VD-AP1 X Gradiente VD-AP2 - Grupo Glutaraldeído............................................................ 50 50 FIGURA 13: Média da PAM - Grupos L-HydroR e Glutaraldeído 51 FIGURA 14: Média da PCP - Grupos L-HydroR e Glutaraldeído . 51 FIGURA 15: Média do DCM - Grupos L-HydroR e Glutaraldeído ........................................................... xi 52 FIGURA 16: Aspecto radiológico de próteses preservada em 58 L-HydroR ................................................................ FIGURA 17: Aspecto radiológico de próteses preservada em Glutaraldeído ........................................................... FIGURA 18: Aspecto macroscópico das próteses (Grupo LHydroR) pós explante ............................................... FIGURA 19: Aspecto macroscópico das próteses (Grupo Glutaraldeído) pós explante .................................... 58 62 63 FIGURA 20: Aspecto macroscópico das próteses (Grupo LHydroR) pós explante - Aderência parcial de 63 cúspides à parede do tubo ........................................ FIGURA 21: Aspecto macroscópico das próteses (Grupo LHydroR) pós explante - Aderência total de cúspides 64 à parede do tubo ...................................................... FIGURA 22: Aspecto microscópico das próteses - Grupo LHydroR) - Coloração por hematoxilina-eosina ........ FIGURA 23: Aspecto microscópico das próteses - Grupo LHydroR) - Coloração por hematoxilina-eosina ........ FIGURA 24: Aspecto microscópico das próteses - Grupo LHydroR) - Coloração por hematoxilina-eosina ........ FIGURA 25: Aspecto microscópico das próteses - Grupo Glutaraldeído - Coloração por hematoxilina-eosina xii 65 66 66 67 Lista de Tabelas TABELA 1: Medidas hemodinâmicas - sacrifício ....................... 52 TABELA 2: Medidas hemodinâmicas - sacrifício ....................... 53 TABELA 3: Análise estatística - variáveis quantitativas (hemodinâmica) ....................................................... 54 TABELA 4: Contratilidade do VD e obstrução da VSVD pela angiografia ............................................................... 56 TABELA 5: Estenose da valva pulmonar e da AP pela angiografia ............................................................... 57 TABELA 6: Refluxo valvar pulmonar e refluxo tricúspide por angiografia ............................................................... 57 TABELA 7: Mensuracão de calcificacão (mamografia) .............. 59 TABELA 8: Análise estatística mamografia (Grupos L-HydroR e Glutaraldeído) .......................................................... 60 TABELA 9: Mensuracão de calcificacão (macroscopia) ............. 61 TABELA 10: Análise estatística macroscopia (Grupos L-HydroR e Glutaraldeído) ....................................................... 62 TABELA 11: Mensuracão de calcificacão (microscopia) .............. 65 TABELA 12: Análise estatística microscopia (Grupos L-HydroR e Glutaraldeído) .......................................................... 68 Dosagem de cálcio por espectrofotometria de absorção atômica ..................................................... 69 TABELA 13 xiii Lista de abreviaturas e siglas DATASUS Banco de dados do Sistema Único de Saúde PEG Polietilenoglicol HE Hematoxilina-eosina cm centímetro TGP Transaminase glutâmico pirúvica TGO Transaminase glutâmico oxalacética VE-Ao Ventrículo esquerdo-Aorta (gradiente) mm milímetro oC Graus centígrados SC Subcutâneo ml mililitro VO Via oral IV Intravenoso IM Intramuscular mg miligrama UI Unidade Internacional L/min litros por minutos FiO2 Fração inspirada de oxigênio O2 Oxigênio g grama DC Débito cardíaco DCM Débito cardíaco médio PMVD Pressão média de ventrículo direito PMVD1 Pressão média de ventrículo direito (cirurgia de implante) PMVD2 Pressão média de ventrículo direito (sacrifício) xiv VSVD Via de saída de ventrículo direito GRAD. Gradiente AAALAC American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care COBEA Colégio Brasileiro de Experimentação Animal CEC Circulação extracorpórea mmHg Milímetro de mercúrio O2 Oxigênio Gama GT Gama glutamil transferase VD-AP Ventrículo direito - artéria pulmonar (gradiente) VD Ventrículo direito VE Ventrículo esquerdo F French CD Compact disc kV kilowatt HNO3 Ácido nítrico ug micrograma mg/L miligrama por litro mcg/dL micrograma por decilitro g/dL Grama por decilitro mm3 milímetro cúbico micromol/L Micromol por litro Kg Kilograma U/L Unidades por litro mEq/L Miliequivalente por litro PAM Pressão de artéria pulmonar PSAP Pressão sistólica de artéria pulmonar PSAP1 Pressão sistólica de artéria pulmonar (cirurgia de implante) xv PSAP2 Pressão sistólica de artéria pulmonar (sacrifício) PVC Pressão venosa central PO Pós operatório AD Átrio direito PCP Pressão capilar pulmonar mamog. mamografia CC Centímetro cúbico % Porcento O2/Kg Oxigênio por kilograma CPK Creatinofosfoquinase SF Solução Fisiológica M Mol SPSS Statistical Package for the Social Sciences Glutarald. Glutaraldeído no Número R Marca Registrada xvi RESUMO Introdução: As biopróteses valvares cardíacas estão relacionadas a eventos tromboembólicos, infecciosos e degenerativos. Seu desgaste é atribuído principalmente à desnaturação do colágeno. O glutaraldeído, método predominante de preservação de biopróteses, favorece o processo de calcificação e limita sua durabilidade. Diversas técnicas tentam conter o processo degenerativo das biopróteses. Objetivos: Avaliar o processo de calcificação, in vivo, de heteroenxertos pulmonares valvados, preservados em meios não aldeídico (L-HydroR). Métodos: 17 carneiros foram submetidos à substituição do tronco da artéria pulmonar por enxerto tubular valvado de pericárdio bovino. Os animais foram distribuídos em dois grupos: Grupo L-HydroR (teste / n=14) e Grupo Glutaraldeído (controle / n=3). Cerca de 150 dias pós implante, foram realizadas angiografia, medidas hemodinâmicas e sacrifício. Os animais foram necropsiados e as próteses submetidas a estudo anátomo-patológico, avaliação radiológica e dosagem do cálcio por espectofotometria de absorção atômica. A análise estatística foi obtida através dos testes exato de Fisher, T de Student ou Mann-Whitney (significância: 5%). Resultados: O desempenho hemodinâmico e angiográfico das próteses testadas foi semelhante nos dois grupos. A avaliação radiológica, a macroscopia, a microscopia e a dosagem de cálcio por espectrofotometria de absorção atômica mostraram maior calcificação nas próteses do Grupo Glutaraldeído, quando comparadas às próteses do Grupo L-HydroR (p=0,001). 07 animais do Grupo L-HydroR (50%) apresentaram aderência das cúspides à parede do tubo (p=0,228). Conclusões: As próteses preservadas em L-HydroR mostraram-se mais resistentes à calcificação, quando comparadas às preservadas em Glutaraldeído. xvii INTRODUÇÃO 2 Introdução Pacientes portadores de valvulopatia cardíaca, quando indicado o tratamento cirúrgico, convivem com um importante e delicado problema – a escolha do substituto valvar. Sabe-se que o tratamento cirúrgico das valvulopatias reduz substancialmente a mortalidade, bem como proporciona a melhoria da qualidade de vida dos pacientes, quando comparado ao tratamento clínico. Os substitutos valvares existentes, entretanto, possuem limitações significativas. Pelo fato de serem tecidos estranhos ao organismo humano, as próteses valvares estão associadas aos riscos de complicações tromboembólicas, degenerativas e infecciosas (SODIAN et al., 2000). Enquanto as próteses mecânicas, altamente trombogênicas, requerem terapia anticoagulante de longa duração, as próteses biológicas, sejam elas criopreservadas ou fixadas em glutaraldeído, apresentam limitação de durabilidade com disfunção progressiva causada principalmente pela degeneração tecidual. De acordo com dados do ministério da saúde, através do banco de dados do DATASUS, foram realizadas no ano de 2009 no Brasil mais de 115 mil procedimentos em cirurgia cardiovascular. Destas, 10.090 cirurgias representaram troca de uma ou mais valvas cardíacas. No ano anterior (2008), este número atingiu 9.839 cirurgias de troca valvar. Em 2010 11.317 cirurgias de troca valvar foram realizadas. Até o mês de abril de 2011 as cirurgias de troca valvar já somam 3.757. Entre as opções de substitutivos valvares, as próteses mecânicas e as biológicas são, atualmente, mais acessíveis. A distribuição entre prótese mecânica e biológica é equilibrada. Aproximadamente 50 a 60% delas apresentarão algum tipo de problema nos primeiros dez anos de pós-operatório, 3 Introdução ocasionando reoperação ou morte (BLOOMFIELD et al., 1991). Estima-se que o número de operações para substituição de valvas cardíacas triplique nas próximas cinco décadas (MOL et al., 2009). Os primeiros registros de tratamento das doenças valvares pela substituição cirúrgica das valvas doentes por próteses artificiais datam do final da sexta década do século passado. Assim, coube a LONG et al. (1959); BRAUNWALD et al. (1960); HARKEN et al. (1960); HUFNAGEL e CONRAD (1961); KAY et al. (1961); LILLEHEI et al. (1961); LITTLEFIELD e MULLER (1961) e STARR & EDWARDS (1961) divulgarem os primeiros relatos de sucesso dessa opção terapêutica. A busca pela confecção de substitutivos valvares através de tecidos orgânicos tem sido alvo do estudo de vários autores ao longo dos últimos sessenta anos. Assim, TEMPLETON & GIBBON (1949) utilizaram pericárdio, ABSOLON et al. (1959) - diafragma, ARCHER (1965) mesentério, LOUGHRIDGE et al. (1965) e GEHA et al. (1970) - tecido autógeno de reação ao aço ou silicone, SENNING (1966) e FLEGE et al. (1967) - fascia lata, FADALI et al. (1970) - peritônio e PUIG & VERGINELLI (1971) - dura máter. Os primeiros registros de utilizacão de valvas heterólogas (porcos) datam de 1965 e foram concebidas por DURAN & GUNNING. BINET et al. (1965), e O’BRIEN & CLAREBROUGH (1966) foram os primeiros a utilizar valvas aórticas heterólogas (porcos ou bezerros) em humanos. Já CARPENTIER et al. (1967) e IONESCU et al. (1967) foram os 4 Introdução responsáveis pelas primeiras substituições de valva mitral utilizando valvas heterólogas. Ainda na busca pelo substitutivo valvar ideal, MURRAY et al. (1956), MURRAY (1960), e BEALL et al. (1961), testaram o implante de valva aórtica homóloga na aorta descendente de pacientes com insuficiência aórtica. Tais resultados inspiraram ROSS (1962) a realizar a primeira substituicão da valva aórtica humana por valva aórtica homóloga. O sucesso com esse procedimento, entretanto, foi obtido por BARRATTBOYES (1964). GEHA et al. (1967) propuseram a montagem prévia das valvas aórticas homólogas em suporte rígido metálico, como forma de reduzir a incidência de insuficiência aórtica pós operatória. WELDON et al. (1966 e 1967), FUCHS et al. (1967), ANGELL et al. (1967) e PALMA et al. (1988) utilizaram valva aórtica homóloga montada em suporte na substituição de valva mitral. BUFFOLO et al. (1973) utilizou valva aórtica homóloga montada em suporte metálico na substituição de valva aórtica ou mitral. O grande desafio no tratamento cirúrgico das doenças valvares é a obtenção de um substitutivo capaz de oferecer qualidade de vida, segurança e durabilidade, a partir da confecção de biopróteses e a identificação de materiais (agentes) voltados à sua preservação, que garantam o bom funcionamento de sua estrutura, diminuindo a destruição e desarranjo das fibras do colágeno e, consequentemente, a incidência de calcificação dessas próteses (SODIAN et al., 2000). 5 Introdução Atualmente, as opções geralmente recaem entre a prótese biológica ou mecânica. Em qualquer das situações, estão previstas vantagens e desvantagens que podem influenciar o resultado tardio e, portanto, o prognóstico a longo prazo. Em se tratando de próteses mecânicas, a expectativa pela resolução definitiva da patologia cardíaca, sem a necessidade de reoperações, implica num rigoroso acompanhamento do paciente além da inconveniência e risco decorrente da anticoagulação definitiva. Já no caso das próteses biológicas, o processo natural de desgaste e calcificação ao longo do tempo, impõe ao paciente a possibilidade da reoperação. O desgaste das biopróteses é atribuído a três fatores: 1. Reação imunológica: Observada pela presença de grandes focos de linfócitos, células plasmáticas e macrófagos. 2. Reação inflamatória: Observada pelo aumento de eosinófilos e alterações degenerativas das fibras de colágeno; 3. Desnaturação do colágeno e elastina: Considerado o maior dos problemas biológicos nas próteses. A utilização de homoenxertos nas substituições valvares possui vantagens e desvantagens semelhantes às biopróteses. Entretanto, a escassez de oferta destes enxertos, bem como a estrutura necessária à sua regular utilização, limita seu uso como opção de tratamento (SACKS et al., 2009). 6 Introdução Os heteroenxertos, assim como os homoenxertos, requerem a aplicação de métodos de preservação que visam impedir a formação de anticorpos e tornar a matriz do tecido conjuntivo resistente à degradação (GABBAY et al., 1988). A degeneração das biopróteses valvares continua a figurar dentre os principais problemas envolvendo o tratamento de pacientes portadores de cardiopatias valvares. Essa degereração pode estar relacionada a fatores mecânicos, decorrentes ou não do processo de fabricação. Sabe-se que as valvas fabricadas a partir de pericárdio bovino sofrem maior desgaste durante o fechamento das cúspides. Já nas próteses porcinas, esse desgaste ocorre mais intensamente durante a abertura dos folhetos devido às características do desenho da válvula (GABBAY et al., 1988). Na tentativa de reduzir o ritmo de desgaste e, consequentemente, prolongar a vida útil das próteses biológicas, algumas técnicas de preservação têm sido propostas com o objetivo de reduzir o processo de calcificação. O primeiro agente utilizado para preservação de próteses valvares foi o cialit, um sal organo-mercurial (BINET et al., 1965). O ácido formaldeído tamponado a 4% (O’BRIEN, 1965) e o glicerol a 98% (PUIG et al., 1972) também foram testados. Entretanto, apesar do formaldeído ter se mostrado eficaz na redução da antigenicidade e do glicerol demonstrar boa performance hemodinâmica, os resultados em relação à durabilidade foram insatisfatórios, com taxas de disfunção que variaram de 90% em 7 Introdução quatro anos, no caso do cialit, 38% em três anos, para o ácido formaldeído e 18% em seis anos, no caso do glicerol. As biopróteses valvares, comumente, são preservadas em glutaraldeído. Esse método está associado à maior agregação de fibrina, macrófagos, cálcio e material trombótico à superfície da prótese. O glutaraldeído, como método de preservação de prótese biológica, foi introduzido na prática clínica em 1968 com resultados que chegaram a 77% de manutenção de função para próteses implantadas em posição mitral, 89% em posição aórtica e 96% em posição tricúspide, num segmento de seis anos (CARPENTIER et al., 1974). Associado ao baixo custo e à sua solubilidade em água, a fixação em glutaraldeído em baixas concentrações (0,5%), desde então, tem sido o mecanismo de escolha para preservação de biopróteses valvares cardíacas. Diversos estudos nestas quatro décadas demonstram sua capacidade de redução da antigenicidade e da degradação proteolítica no pós implante (HUGHES et al., 1994). Apesar dessa inegável contribuição, o glutaraldeído contido na superfície do tecido protético é citotóxico. Sua ação ocorre através de ligações cruzadas com as proteínas do tecido protético valvar. O processo de degeneração das biopróteses valvares preservadas em glutaraldeído ainda não está totalmente esclarecido. Alguns mecanismos, entretanto, têm sido propostos: 1) Alterações moleculares na matriz do colágeno; 2) Criação de espaços intersticiais com exposição à formação de 8 Introdução calcificação; 3) Oxidação de grupos de aldeídos livres no plasma; 4) Lenta liberação de glutaraldeído presente no tecido protético levando à interrupção da regulação celular de cálcio; 5) Redução do gradiente transmembranoso de cálcio, favorecendo a deposição e formação de núcleos de calcificação (OOSTHUYSEN et al., 2006; JORGE-HERRERO et al., 2010). A principal desvantagem da fixação das biopróteses em glutaraldeído é a consequente calcificação dos tecidos ao longo do tempo (SODIAN et al., 2000), o que favorece a disfunção e a necessidade de substituição cirúrgica da prótese. Sabe-se que esse mecanismo de calcificação tecidual tem início na desvitalização celular a partir da fixação da bioprótese em glutaraldeído (SCHOEN et al., 2005). Por se tratar de método citotóxico, a fixação em glutaraldeído favorece reação imunogênica, o que, pelo menos em parte, limita a durabilidade e favorece o processo degenerativo das biopróteses (SIMIONESCU, 2004; KIM et al., 2006). A desnaturação do colágeno, independente da calcificação propriamente dita, representa importante fator contribuidor para a limitada durabilidade das biopróteses (VESELY et al.,2001). Na busca por novos mecanismos de preservação das próteses biológicas, tem sido estudada a utilização de agentes anticalcificantes. Nesse contexto, alguns estudos demonstram bons resultados a partir da 9 Introdução utilização de preservação à base de fotooxidação, fluosol-polietilenoglicol, etanol, ácido alfa-amino-oléico e sulfato duodecil de sódio, além de métodos de descelularização e reconstrução com engenharia tecidual. Diversas técnicas foram aplicadas com o objetivo de atenuar o processo de calcificação nos tecidos tratados com glutaraldeído, incluindo tratamento com surfactantes (CARPENTIER et al., 1984), ácido alfaamino-oléico (GOTT et al., 1992), ferro (CARPENTIER et al., 1995), aplicação complementar com calor (CARPENTIER et al., 1998), etanol, éter, isoladamente ou associados (SHEN et al., 2001), ácido L-glutâmico (GRIMM et al., 1992; BRAILE et al., 2011). Na tentativa de melhorar a performance e a durabilidade das biopróteses fixadas em glutaraldeído, diversas estratégias foram propostas. Um desses métodos adotou o revestimento da superfície da prótese com células endoteliais. Tal revestimento, entretanto, mostrou-se ineficaz devido à incapacidade de reepitelização das valvas fixadas em glutaraldeído (FISCHLEIN et al., 1992; HOFFMANN et al., 1992; BENGTSSON et al., 1993; FISCHLEIN & FASOL, 1996). Outros métodos tentaram aumentar a capacidade de adesão celular das próteses fixadas em glutaraldeído a partir do pré tratamento das próteses com soluções de aminoácidos (FISCHLEIN et al., 1994) ou com ácido cítrico (GULBINS et al., 2003) e pré revestimento das próteses com fibronectina ou fatores de crescimento (FISCHLEIN et al., 1994). Técnicas in vitro, visando a redução da citotoxicidade do glutaraldeído e o revestimento da superfície da prótese com células da medula óssea, demonstraram o aumento da adesividade 10 Introdução celular com consequente capacidade de reendotelização do tecido (KIM et al., 2006). Métodos alternativos também foram testados, como a utilização de substâncias anticalcificantes, como diaminas, dimetil-amino-propil, etilcarbodimida e hexadiamina (GIRARDOT et al., 1996), associação entre glutaraldeído e ácido alfa-amino-oléico, que se caracteriza por inibir a entrada de cálcio nas células teciduais (ZILLA et al., 2005), poliacrilamida hidrogel (OOSTHUYSEN et al., 2006), foto-oxidação, associada ou não à fixação em glutaraldeído (MOORE et al., 1998; MEURIS et al., 2003). Na tentativa de ampliar a durabilidade das biopróteses valvares, diversos estudos tentam substituir o glutaraldeído como método de fixação e preservação das próteses. Estudos in vitro e in vivo compararam o processo de calcificação de biopróteses valvares pré-tratadas com glutaraldeído e um modelo anticalcificante introduzido pelo Instituto BIOCOR (Belo Horizonte/Basil), demonstrando redução significativa da calcificação in vivo e in vitro nas próteses tratadas pelo método no-react (ABOLHODA et al., 1996). Mais recentemente, algumas tentativas de manejo químico do glutaraldeído demonstraram redução da toxicidade e obtiveram resultados promissores na diminuição do processo de calcificação in vivo (JORGEHERRERO et al., 2010). 11 Introdução O desafio atual de engenharia tecidual é estudar e propor a criação de substitutivos teciduais e valvares cardíacos a partir de estruturas artificiais e biológicas que sejam biocompatíveis, não trombogênicas, não teratogênicas, duráveis e que possibilitem o acompanhamento do crescimento do hospedeiro (CEBOTARI et al.,2010; SACKS et al., 2009; KNIGHT et al., 2008). Teoricamente, a alternativa a todas essas limitações metodológicas seria a utilização de próteses que, tratadas, permitissem a epitelização espontânea com células do hospedeiro (FRATER et al., 1992). Na busca por publicações acerca dessa nova metodologia, encontrou-se, apenas, três estudos experimentais que compararam o desempenho hemodinâmico e a histologia de próteses valvulares implantadas em carneiros, comparando a conservação e tratamento em glutaraldeído versus a preservação não aldeídica (L–HydroR): 1. “Comparative Study of the L–Hydro R process and glutaraldehyde preservation”. Esse estudo comparou próteses preservadas em L-HydroR (PEG) e em glutaraldeído, implantadas em posição mitral de dez carneiros jovens, analisadas cinco meses após implante. A avaliação foi realizada através de ecocardiografia, angiografia, histologia e histoquímica (NINA et al., 2005). Nesse estudo, NINA et al. (2005), demonstraram que próteses implantadas em posição mitral de carneiros, tratadas com solução não- 12 Introdução aldeídica, tiveram melhor rendimento hemodinâmico, caracterizado pela ausência de regurgitação e menor pressão capilar pulmonar média, se comparada com as próteses tratadas com solução aldeídica. O mesmo estudo demonstrou que a baixa toxicidade das próteses preservadas em L–HydroR, permitiu a reendotelização espontânea por células do hospedeiro, conferindo maior resistência à calcificação e à trombogenicidade. Nesse sentido, as próteses tratadas convencionalmente, em glutaraldeído, apresentaram calcificação macroscópica e microscópica, além de deposição de material trombótico. A endotelização, como mecanismo para minimizar ou retardar a degeneração estrutural, mostrouse como uma possibilidade real, desde que o tecido valvar possa ser preservado por um agente com as características do polietilenoglicol (PEG), tornando-o propício à recelularização por células do hospedeiro em virtude da sua baixa toxicidade, da sua capacidade de atenuar os xenoantígenos e de manter preservada a estrutura histológica valvar (LEHNER et al., 1996). Em seu estudo, NINA et al. concluíram que a preservação nãoaldeídica, em PEG (L–HydroR), propiciou a endotelização espontânea, com evidência de boa adesividade do novo endotélio à matriz do colágeno, além de mostrar maior resistência à calcificação e à formação de trombos, quando comparada à preservação aldeídica convencional. 2. “Stentless valves treated by the L–HydroR process in the aortic position in sheep”, que comparou a preservação L-HydroR, versus a preservação em Glutaraldeído. Nesse estudo, também experimental, o 13 Introdução número de animais comparados foi de 24 carneiros, sendo em 14 animais implantadas próteses preservada em L-HydroR, e em 10 animais implantadas próteses preservadas em Glutaraldeído. SANTOS et al., avaliaram a incidência de calcificação tardia em próteses porcinas, implantadas em posição aórtica. Nesse estudo, ao contrário do anterior, não foram observadas diferenças no desempenho hemodinâmico, definido como ausência de regurgitação aórtica importante, equivalência de pressão capilar pulmonar, ausência de gradiente VE-Ao importante. Após 150 dias de implante, foi realizada avaliação de medidas hemodinâmicas, ecocardiográficas e angiográficas, assim como análise histológica (SANTOS et al., 2007). Na avaliação macroscópica das próteses explantadas, houve nítida diferença entre os grupos com presença de maior quantidade de pontos de calcificação nas próteses tratadas em glutaraldeído. Ainda em relação à calcificação, a microscopia ótica mostrou diferença significante, em favor das próteses tratadas em L–HydroR. A exemplo do demonstrado por NINA et al., a avaliação macroscópica não verificou a presença de trombos nessas próteses, denotando a formação de novo epitélio, conforme demonstrado por ele através da microscopia eletrônica de varredura. A integridade do novo endotélio foi caracterizada pelo contato desse com a matriz do tecido conjuntivo, conferindo, dessa maneira, resistência à insudação de proteínas plasmáticas e sais, precursores da degeneração bioprotética (EYBL et al., 1992). 3. “Estudo experimental comparativo do enxerto homólogo pulmonar tratado pelo processo L-HydroR com homoenxerto 14 Introdução pulmonar a fresco”. Nesse estudo, os autores comparam morfológica e funcionalmente, o homoenxerto pulmonar preservados pelo método LHydroR , com o homoenxerto a fresco, implantados em 14 carneiros jovens, e avaliados após um período de 320 dias. Os autores concluíram que o desempenho clínico e hemodinâmico dos homoenxertos foram semelhantes, apesar do desempenho ecocardiográfico ter sido superior no grupo tratado em L–HydroR . Além disso, a partir da utilização da microscopia eletrônica de varredura e da microscopia eletrônica de transmissão, demonstraram que homoenxerto tratado pelo método L– HydroR apresentou evidência histológica de repopulação celular intersticial e endotelial (REY et al., 2011). Nesses três estudos, evidenciou-se baixos níveis de calcificação das próteses preservadas em L–HydroR, sempre com significância estatística, bem como a indução espontânea de endotelização, principalmente quando comparadas àquelas tradicionalmente preservadas em gluraldeído, conforme objetivo das duas primeiras citações. O polietilenoglicol (PEG) é uma família de polímeros de cadeia longa composto de subunidades de etileno glicol. Possui grande capacidade de formação de complexos, devido ao grande número de partículas de oxigênio em sua cadeia polimérica - HO-CH2-(CH2-O-CH2-)n-CH2-OH. O Polietilenoglicol é produzido pela interação de óxido de etileno com água, etileno glicol ou oligômeros de etileno glicol. A reação é catalisada por ácidos ou bases. Sua característica hidrófila da cadeia de 15 Introdução polioxietileno da linha do polietilenoglicol permite a obtenção de um polímero higroscópico e altamente solúvel em água. Polietilenoglicois (PEGs) reagem com ácidos graxos para fazer detergentes que têm espessamento e espuma de estabilização como propriedades. Quando quimicamente combinado com ácidos graxos do óleo de coco, por exemplo, faz detergentes, que são usados em xampus como surfactante, emulsificante e estabilizante de espuma. PEG é usada como espessante em muitos produtos. Dentre eles, no creme dental, impedindo que as bactérias rompam os pirofosfatos, controlando assim o acúmulo de tártaro. São usados na indústria como surfactantes, incluindo alimentos, cosméticos e farmacêuticos; em biomedicina, como agentes dispersantes, solventes, pomada e bases de supositório; em veículos, como excipientes, e como laxantes (WIKIMEDIA FOUNDATION - http://en.wikipedia.org/wiki/ Polyethylene_glycol, 2010). Além dessas características, possui baixa toxicidade por se tratar de um composto quimicamente inerte. Quando em contato com a corrente sanguínea é excretado completamente pelo rim, sem sofrer metabolização. Essas propriedades asseguram sua aplicabilidade clínica como veículo para dissolver fármacos pouco solúveis em água, como a reserpina e a nitrofurantoína e aqueles facilmente hidrolisáveis, como os barbituratos alcalinos (PRESTA et al., 1995; UNICAMP, 2003). 16 Introdução Alguns estudos experimentais in vitro utilizaram o PEG adicionado à solução de preservação miocárdica de “Saint Thomas” e da “University of Wisconsin”. Nessa comparação, a associação com PEG mostrou maior eficácia e garantiu a viabilidade funcional do coração por até 24 (vinte e quatro) horas contra as quatro a seis horas obtidas com as soluções tradicionalmente utilizadas isoladamente (BHAYANA et al., 1997). A capacidade de preservação mais prolongada se deve à ação osmótica do PEG, que estabiliza a membrana, tornando-a menos permeável ao soluto extracelular e, consequentemente, prevenindo o edema celular (WICOMB et al., 1992). A combinação do antígeno específico com o PEG, resultando na redução da antigenicidade, confere propriedade imunossupressora ao PEG, como demonstrado quando se associou 5% de PEG à solução de preservação miocárdica utilizada em transplante cardíaco. Essa associação reduziu em 30% a incidência de rejeição no grupo de pacientes transplantados que utilizaram tal solução. A ação imunossupressora decorre da ligação do PEG com os lipídeos da membrana celular dos antígenos, formando complexos reversíveis, interferindo na ativação dos macrófagos e das células T-helper, induzindo ao estado de tolerância aos antígenos do doador, reduzindo a imunogenicidade (COLLINS et al., 1991). Nesse contexto, o presente estudo avança na avaliação do processo de endotelização espontânea dos substitutivos valvares, desta vez, testando o desempenho do modelo de preservação em polietilenoglicol (L–HydroR) em próteses tubulares valvadas, implantadas no tronco da artéria pulmonar de carneiros. OBJETIVOS 18 Objetivo Avaliar os processos de degeneração estrutural, in vivo, de heteroenxertos pulmonares valvados, preservados em L–HydroR e implantados em ovinos, com período mínimo de observação de cinco meses. MÉTODOS 20 Métodos Este protocolo foi conduzido de acordo com os Procedimentos Operacionais Padrão do Laboratório de Pesquisas da Labcor Laboratórios – Centro de Pesquisas. O estudo teve a supervisão do Controle de Qualidade - Labcor Laboratórios. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) sob o número 1761/08 ESPÉCIE EM TESTE – OVINO Justificativa: O ovino (raça Santa Inês) foi escolhido como a espécie experimental a ser usada, pelas seguintes razões: A. O tamanho desse animal permite, tecnicamente, a realização do implante do conduto pulmonar valvado. B. O tamanho do coração do ovino é comparável ao de humanos, permitindo, assim, o implante de biopróteses vasculares tubulares de tamanho clínico (4 a 6cm). C. O ovino é, relativamente, fácil de ser mantido por longos períodos após a realização do procedimento. D. A experiência do laboratório com esse modelo experimental permitiu um julgamento mais racional a respeito de complicações ocorridas durante o estudo. 21 Métodos DESCRIÇÃO E REQUERIMENTO DE ANIMAIS A - Todos os animais pesavam entre 27 – 35kg (média de 32,5Kg +/-2Kg), sendo 03 fêmeas e 14 machos castrados. B - Antes de entrarem no estudo, eles foram considerados livres de doenças e receberam certificado de saúde fornecido pelo médico – veterinário. C - A idade dos animais variou de 6,13 a 8,13 meses (média de 6,8 meses +/-0,6 meses). A idade ainda foi confirmada pelo tempo de erupção e pelas mudanças na tábua dental. D - A origem de cada animal foi devidamente documentada. E – Todos os animais foram vermifugados e vacinados na chegada ao Centro de Pesquisa. CASUÍSTICA Quatorze (14) animais receberam o implante da bioprótese a ser testada (L-HydroR) - GRUPO L-HydroR (teste). Três (03) animais receberam o implante da bioprótese controle preservadas em glutaraldeído GRUPO Glutaraldeído (controle). O número de animais participantes foi definido a partir de cálculo amostral e obedeceu à International Standardzation Organization - ISO 5840, 3a edição, publicada em 1996 e revisada em 2005. 22 Métodos CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO E INCLUSÃO DE NOVOS ANIMAIS Os animais que morreram antes de 24 horas de pós–operatório foram consideradas mortes cirúrgicas e foram excluídos do estudo. Animais adicionais foram incluídos no estudo e submetidos à cirurgia para ser preenchido o critério de população fornecida anteriormente. Os animais que morreram antes da data prevista para o sacrifício foram examinados e submetidos à necropsia como descrito na secção “PROTOCOLO DE PATOLOGIA”. A funcionalidade da bioprótese e a causa da morte foram determinadas, quando possível, pelo patologista do estudo. ALOJAMENTO DOS ANIMAIS Os animais foram alojados e isolados dos outros animais do estudo, pelo período de cinco dias, antes de entrarem para o estudo. Todos os animais foram alojados de acordo com a normas estabelecidas pela AAALAC (AMERICAN ASSOCIATION for ACCREDITATION of LABORATORY ANIMAL CARE) sob condições sanitárias adequadas, alimentação balanceada e água à vontade. 23 Métodos MANUSEIO E CUIDADO Toda ferida cirúrgica foi verificada, pelo menos uma vez ao dia. Caso alguma alteração fosse notada, o pesquisador e o veterinário responsável eram comunicados, sendo registrada no histórico do animal. MATERIAL EM TESTE A prótese utilizada consiste em um patch de pericárdio bovino corrugado, tratado pelo processo L-HydroR. O fechamento do tubo é feito com 2 planos de sutura. Uma válvula, confeccionada de pericárdio porcino, com tratamento em L-HydroR, é fixada no interior do tubo. Uma vez montado, o tubo é testado quanto a competência da válvula e verificada a não existência de vazamentos. Aprovada, a prótese é esterilizada em solução de peróxido de hidrogênio e etanol e, posteriormente, embalada em solução de etanol a 50%. Teste de esterilidade é feito através de amostras incubadas em meios de cultura FTM, Middlebrook e STB durante 14 dias. Comprovada a esterilidade, a prótese é liberada. A técnica de preservação em L-HydroR consiste de três etapas distintas: 24 Métodos 1ª ETAPA: Extração dos antígenos e oxidação química dos antígenos remanescentes com polietilenoglicol. 2ª ETAPA: Esterilização em peróxido de hidrogênio. 3ª ETAPA: Estoque das próteses em solução de etanol a 50%. Cada prótese possuía qualidade e diâmetro determinados (17 ou 19 mm). Cada prótese foi identificada pelo número do animal no estudo. O número da prótese foi registrado em todos formulários associados ao animal e ao procedimento operatório. As próteses (Figura 01) utilizadas nesse estudo foram confeccionadas a partir de pericárdio bovino, sendo compostas por um segmento tubular e outro composto por três folhetos valvares. FIGURA 01: Tubo valvado de pericárdio bovino, com cúspides de pericárdio porcino, preservado em L-HydroR 25 Métodos PROTOCOLO A – Protocolo de recebimento de animais: Nenhum animal possuía sinais de infecção aparente ou anormalidade congênita que justificassem a rejeição do animal. Atenção especial foi dirigida ao sistema respiratório, não sendo evidenciado quadro de pneumonia ou outros problemas respiratórios que resultassem na rejeição do animal. Nenhum animal apresentou temperatura retal acima de 40ºC. Logo após o exame clínico, o animal recebeu número individual, sendo preenchida ficha contendo todos os cuidados recebidos durante a permanência do mesmo no estudo. Foram administradas Vacinas Biodectin 2, via SC, Ivomec (Ivermectina 1%) – 0,02ml por Kg via SC, Valbazen 10 Cobalto (Albendazole) 2ml via oral. Cada animal permaneceu isolado por cinco dias, para então ser alojado junto aos animais já controlados. O histórico de cada animal permanece arquivado. Os animais permaneceram sob cuidados veterinários diários e receberam tratamento de acordo com a publicação MANUAL SOBRE CUIDADOS E USOS DE ANIMAIS DE LABORATÓRIO, preparado pelo NATIONAL RESEARCH COUNCIL – INSTITUTE OF LABORATORY ANIMAL RESOURCES editado pela parceria AAALAC e COBEA. E foram mantidos em instalações adequadas, recebendo alimentação balanceada, controle de verminose e imunizações periódicas. 26 Métodos B – Pré-operatório Cada animal foi alojado na sala de pré–operatório 24 horas antes da cirurgia, junto ao bloco cirúrgico, quando era retirado todo alimento sólido da baia do animal. Seis horas antes da cirurgia, começava o jejum hídrico. C – Indução anestésica e anestesia Quinze minutos antes da indução anestésica, administrava-se 01mg de sulfato de atropina IM. A indução anestésica era feita por via intravenosa (IV) com 12,5mg/kg de Thiopental. Um catéter era colocado na veia jugular externa esquerda e fixado por meio de sutura. Essa via endovenosa permanecia até o final do ato operatório. Uma torneira de três vias era conectada ao catéter e, a esta, um equipo de soro, por onde eram administrados medicamentos e soluções eletrolíticas. Naquele momento, eram administrados, por via intravenosa, 6ml de dexametasona (Azium), 1g de Ampicilina Sódica intravenosa (IV), que eram repetidos a cada três horas de cirurgia. O animal era, então, intubado e ventilado artificialmente. Uma sonda gástrica era colocada, e através dela, eram administrados 150CC de solução antiácida. A sonda permanecia fechada até o início da circulação extracorpórea (CEC). 27 Métodos Foi feita ampla tricotomia da região torácica esquerda, e o animal transportado para a sala de operação, colocado na mesa cirúrgica e conectada a monitorização eletrocardiográfica. O tubo orotraqueal era conectado e se iniciava a ventilação mecânica com o volume de 10 a 15ml de O2/kg, numa freqüência de 8 a 12 ciclos por minuto. A anestesia foi mantida pela administração de Halotano na concentração de 1 a 1,5%, de Thiopental, de acordo com a necessidade, e o relaxamento muscular obtido pela administração intravenosa de 100mg de Cloreto de Succinilcolina. D – Técnica operatória A antissepsia do campo operatório foi feita com dermoiodine diluído em soro fisiológico por 5 a 10 minutos e com spray de demoiodine. A área cirúrgica foi, então, enquadrada com campos estéreis, que cobriam todo o animal. Os pacotes com as tubulações estéreis da circulação extracorpórea (CEC) eram abertos e passados ao auxiliar do cirurgião, que as separava e as passava à perfusionista, fixando-as com auxílio das pinças de campo. Eram administrados 100mg de cloreto de succinilcolina IV e realizada toracotomia esquerda ampla penetrando no quarto espaço intercostal. A artéria torácica interna esquerda era ligada com fio de algodão 0, seguindo-se a secção da mesma. O pulmão esquerdo era afastado, com um afastador maleável, sobre uma compressa úmida, para obtenção de boa visualização do campo cirúrgico. 28 Métodos Prosseguia-se com a dissecção da aorta torácica, em seu terço proximal, para a canulação. Os nervos frênico e vago eram isolados. Era realizada a dissecção do tronco pulmonar, desde o plano da valva pulmonar até sua bifurcação. Todos os isolamentos eram feitos com fita cardíaca. O animal era heparinizado (350UI de heparina/kg) e era administrado, naquele momento, 4ml de dexametasona (Azium). Depois de permitir que a heparina circulasse por dois a três minutos, era feita sutura em bolsa na aorta torácica, com fio de poliéster trançado 2-0, ancorado em barra de teflon, para a canulação arterial, e outra, na aurícula direita, para a drenagem do sangue venoso, através de cânula única. Era estabelecida a circulação extracorpórea (CEC), com hemodiluição total e normotermia, sem pinçamento aórtico. O tronco pulmonar era pinçado distalmente após sua bifurcação. O ligamento arterioso era seccionado nesse momento. Após a secção completa do tronco pulmonar, os folhetos nativos da válvula pulmonar eram retirados. O enxerto era lavado a partir da imersão completa do tubo em cuba contendo soro fisiológico 0,9%, sendo mantido imerso por três minutos, repetindo-se este procedimento três vezes. Um segmento do enxerto de aproximadamente 4cm, contendo as cúspides, era preparado para o implante. Anastomosava-se a porção proximal na via de saída do ventrículo direito, com sutura contínua, com fio polipropileno 5-0. Passavase, então, para a sutura da porção distal do conduto à porção do tronco pulmonar relacionada com a bifurcação, também com polipropileno 5-0. Nesse momento era feita a revisão da hemostasia. 29 Métodos A CEC era interrompida após o implante da prótese e a revisão da hemostasia. O animal era estabilizado pelo ajuste do volume sangüíneo e pela administração das drogas requisitadas pelo cirurgião. Com o animal hemodinamicamente estável, era retirada a cânula do átrio direito e da aorta, dando início à administração IV de cloridrato de protamina à razão de 1ml para cada 1000UI de heparina administrada, em intervalos de hum minuto. Todos os sítios de canulação, assim como as anastomoses, eram revisados para a verificação da hemostasia, um dreno torácico era colocado, fazendo-se sutura em forma de bolsa na pele, em volta da incisão, por onde o dreno penetrava, usando-se fio de náilon monofilamentar 2-0 para fixá-lo à pele. O pericárdio era aproximado com fios de seda 2-0. As costelas eram aproximadas com fios de algodão grosso (barbante). A incisão torácica era fechada, usando-se fios de seda 2-0 para a sutura da musculatura intercostal, serrátil do tórax, grande dorsal e subcutâneo, com pontos simples, contínuos. A pele era aproximada com sutura com fios de seda 2-0, aproximando-se o tecido celular subcutâneo, e uma sutura intradérmica com fio de náilon 4-0. A partir do fechamento da parede torácica, já era conectado o dreno torácico a um aspirador a vácuo e se iniciava a drenagem do tórax. O dreno era retirado quando o animal passava a respirar espontaneamente e não havia secreção a ser aspirada. 30 Métodos E – Perfusão 1 – Montagem e início: O pacote com os tubos necessários era aberto, após a cobertura do animal com toalhas estéreis. O auxiliar passava os tubos ao perfusionista, que terminava a montagem do sistema. Uma vez montado o circuito, o fluxo de gás era ajustado para 0,5l/min de oxigênio com FiO2 em 70%. Adicionava-se ao oxigenador de membrana, 2.000ml de solução de ringer com lactato de sódio (Solução Iniciadora ou “Priming Solution”) e 200UI de heparina. Essa solução era aquecida a 37ºC e circulada para que as tubulações fossem totalmente preenchidas por ela, ficando livres de bolhas de ar. O volume da solução era estabilizado após a circulação e preenchimento de todas as tubulações. O volume estabilizado era assinalado no oxigenador e usado como referência para se fazer o ajuste do volume de sangue ao final da CEC. A solução circulava até que o cirurgião estivesse pronto para separar as linhas arterial e venosa e conectá-las às respectivas cânulas. 2. Perfusão Com o anúncio de que o cirurgião estava pronto para separar as linhas do circuito, a circulação da solução iniciadora era interrompida, e a linha de retorno venoso pinçada. O cirurgião separava as linhas e conectava a arterial à cânula da aorta, enquanto a drenagem venosa era feita 31 Métodos através de cânula única, multiperfurada, colocada no átrio direito e conectada a uma linha de aspiração. Simultaneamente, começava o bombeamento da linha arterial e a aspiração do retorno venoso. O perfusionista, então, ajustava o fluxo de gases para 2l/min com 100% de O2. O fluxo desse gás era ajustado de acordo com os resultados da gasometria, e o anestésico inalatório era desligado. A temperatura esofágica permaneceu entre 37,5 e 38,5ºC. Durante a CEC, todas as drogas eram administradas diretamente no reservatório do oxigenador. Análises regulares de sangue arterial eram realizadas em períodos determinados pelo cirurgião. A temperatura esofágica era mantida em torno de 38,5ºC até o momento da saída da CEC. Os pulmões eram cuidadosamente reinsuflados. A CEC era vagarosamente desligada, ocluindo-se, paulatinamente, a linha de retorno venoso e, ao mesmo tempo, diminuindo o fluxo de sangue arterial. Imediatamente antes do fechamento torácico, era introduzido catéter tipo jelco, no 20, na via de saída do ventrículo direito e ao nível do tronco da artéria pulmonar, após a anastomose distal do enxerto tubular. Com o auxílio de um monitor multiparamétrico (Dixtal), eram mensuradas as pressões médias de ventrículo direito (PMVD) e de artéria pulmonar (PMAP). Tais medidas visavam avaliar a existência de gradiente VD-AP. 32 Métodos CUIDADOS E OBSERVAÇÕES A – Cuidados pós-operatórios O animal era observado cuidadosamente durante o período pósoperatório imediato, para o caso de ocorrerem eventos hemorrágicos. Caso necessário, poder-se-ia recorrer à transfusões de sangue. Na primeira oportunidade, a ventilação mecânica era desligada, mas o oxigênio continuava a ser administrado, via tubo ou, se esse fosse removido, através de cânula nasal (3 ou 4l/min). Assim que o animal acordava da anestesia e era restabelecida a pressão negativa intratorácica, o dreno torácico era removido, e o animal era levado para a sala de pós-operatório. Após quatro horas de pósoperatório, eram administrados 1g de ampicilina sódica intramuscular (IM) e 1g de cefazolina sódica, via intramuscular. Durante os sete primeiros dias de pós-operatório, o animal recebia 1g de ampicilina sódica intramuscular (IM) e 1g de cefazolina sódica, via intramuscular duas vezes ao dia. Era administrado, para controle da dor, flunixim IM (Banamine) 2,5mg por Kg de peso a cada 24 horas, por três dias. A temperatura retal era monitorada, pelo menos, uma vez por semana. O animal recebia alta a partir do sétimo dia pós-operatório, caso sua temperatura retal estivesse abaixo de 40,5ºC e suas condições estivessem 33 Métodos satisfatórias. Caso apresentasse febre, o animal continuaria recebendo a terapia antibiótica, ou essa poderia ser alterada. B – Cuidados a longo prazo O animal era observado diariamente nos primeiros sete dias de pósoperatório. Se fosse considerado livre de complicações, após sete dias, era transferido para o biotério de pós-operatório mediato. Lá, o animal continuava a ser observado e avaliado diariamente durante o período prédeterminado de 150 dias, ou enquanto sobrevivesse. Planilhas de cuidados pós-operatórios eram utilizadas diariamente. Quaisquer alterações ou mudanças nas condições dos animais eram registradas. C – Mortes imediatas Qualquer animal que não sobrevivesse às primeiras 24 horas de pósoperatório era considerado como falha técnica de implante e era eliminado do estudo. A causa da morte era determinada, por necropsia, para cada caso. Todo animal que sobrevivesse às primeiras 24 horas, após a cirurgia, mas morresse antes do fechamento do período de acompanhamento prédeterminado para estudo, era submetido a uma necropsia para se determinar a causa mortis. Todos os animais implantados foram submetidos à necropsia. 34 Métodos D – Amostragem sangüínea Amostras eram coletadas de todos os animais implantados, tanto do grupo de controle quanto do grupo de teste. A primeira coleta era feita no período de quarentena, para que o animal entrasse em cirurgia com o exame sanguíneo avaliado. A segunda, aos 07 dias após a cirurgia, a terceira amostra aos 90 dias, ou quando fosse necessário, durante o período do estudo. A última coleta era feita durante o estudo angiográfico, que precedia o sacrifício do animal. Todas as coletas de sangue eram feitas assepticamente. Os seguintes parâmetros foram avaliados: • HEMATOLOGIA: Hemoglobina, hematócrito, plaquetas, leucocitos. • BIOQUÍMICA DO SANGUE: Sódio, potássio, cálcio, fósforo, ferro, fosfatase alcalina, CPK, proteína glicosilada, deidrogenase láctica, creatinina, uréia, TGP, TGO, gama GT, bilirrubinas (totais e frações), glicemia, colesterol, triglicérides, proteínas totais. E – Protocolo de angiografia e medidas hemodinâmicas Estudos foram realizados a partir do 150º dia de pós-operatório, precedendo ao sacrifício e à necropsia. Antes da anestesia, cada animal foi 35 Métodos pesado e foram coletadas, assepticamente, amostras de sangue da veia jugular externa para hematologia e bioquímica do sangue. O animal era anestesiado através da administração intravenosa de thiopental na dose de 12,5mg/kg. O animal era então intubado com um tubo endotraqueal e ventilado mecanicamente. A anestesia era mantida com halotano e propofol (diluído ao soro na proporção de 30ml de soro e 20ml de medicamento) em infusão lenta e contínua. Oxigênio suplementar era administrado. O animal era colocado na mesa em decúbito lateral esquerdo e contido. Era feita a assepsia do lado esquerdo do pescoço, já tricotomizado, cobrindo-se então com campos cirúrgicos. Uma pequena incisão era feita na lateral esquerda do pescoço e a artéria carótida e a veia jugular externa eram expostas e isoladas. Ambos os vasos eram ligados distalmente e circundados proximalmente. O animal era heparinizado à razão de 350UI/ kg. Um catéter (6F) Pigtail era introduzido a partir da artéria carótida comum esquerda até a aorta torácica. Uma medida da pressão arterial sistêmica era obtida. A posição de todo o catéter era verificada por tomadas de pressão e por visão direita através de fluoroscopia. Um catéter (7F) de Swan-Ganz era introduzido a partir da veia jugular externa esquerda . Eram registradas: a) Pressão venosa central, ao 36 Métodos nível do átrio direito; b) Pressão de ventrículo direito, ao nível do VD; c) Pressão de artéria pulmonar, ao nível do tronco da artéria pulmonar. A posição da extremidade do catéter era confirmada por tomadas de pressão e visão direita através de fluoroscopia posicionada em posição antero-posterior. As pressões venosa central e do leito pulmonar eram gravadas simultaneamente numa escala de zero a 40mmHg. Débitos cardíacos eram então obtidos, usando-se a técnica de termodiluição. Três injeções para débito cardíaco eram executadas e a média do débito cardíaco gravada. O catéter de Swan-Ganz era então recuado até o pescoço. Era efetuada a injeção de 40 a 60ml, através de seringa, de contraste iodado diluído em SF 0,9% na proporção 1:1, no ventrículo direito, próximo à artéria pulmonar. Todos os resultados foram gravados em CD. Antes de sacrificar o animal, eram administrados 20ml de Thiopental e o animal era sacrificado com uma injeção de 30ml de Cloreto de Potássio IV. Na avaliação das imagens angiográficas, as variáveis foram analisadas por hemodinamicista, sem que este soubesse o grupo que estaria analisando (avaliação “cega”), sendo interpretadas da seguinte maneira: 1. Refluxo valvar pulmonar: Análise semi-quantitativa (leve, moderada ou importante), baseada na comparação entre as amostras. 2. Refluxo tricuspídeo: Análise semi-quantitativa (leve, moderada ou importante), baseada na comparação entre as amostras. 37 Métodos 3. Estenose valvar ou da artéria pulmonar: a) discreta - quando havia redução inferior a 20% do diâmetro do conduto; b) moderada quando havia redução de 20 a 50% do diâmetro do conduto; c) importante - quando havia redução de mais de 50% do diâmetro do conduto. 4. Contratilidade do VD: a) preservada - quando todo o contraste era expulso da cavidade ventricular; b) reduzida - quando permanecia contraste no interior do VD após a sístole ventricular. 5. Obstrução da VSVD: a) discreta - quando havia redução inferior a 20% da área da VSVD; b) moderada - quando havia redução de 20 a 50% da área da VSVD; c) importante - quando havia redução de mais de 50% da VSVD. F – Patologia 1. Avaliação macroscópica O estudo pesquisou: • Perviedade após um mínimo de 150 dias de implante; • Análise de falência; • Funcionalidade e integridade da prótese; • Recuperação/endotelização; • Coágulos/trombos; • Colonização microbiológica; • Reação do organismo à presença da prótese; • Existência de doença intercorrente no animal. 38 Métodos O grau de calcificação foi quantificada (avaliação semi quantitativa) pelo exame anátomo patológico considerando a graduação: 0- Calcificação inexistente; 1- Calcificação leve; 2- Calcificação moderada; 3- Calcificação importante. 2. Avaliação microscópica Após o exame macroscópico, as próteses explantadas foram fixadas em solução de formaldeído a 10%. O estudo histológico foi realizado para avaliar a deposicão de cálcio e material trombótico na superficie das próteses. As biopróteses foram cortadas, desidratadas em álcool, embebidas em parafina e seccionadas em fragmentos de quatro micrômeros e, então, foram tratadas com hematoxilina-eosina para avaliação de depósitos de cálcio. As lâminas foram observadas em microscópio óptico, por patologista, sem que este soubesse o grupo que estaria analisando (avaliação “cega”). O grau de calcificação foi quantificado (avaliação semi quantitativa) pelo exame anátomo patológico considerando a graduação: 0- Calcificação inexistente; 1- Calcificação leve; 2- Calcificação moderada; 3- Calcificação importante. 39 Métodos 3. Necropsia As necrópsias foram realizadas em todos os casos. No começo da necropsia, o coração e o tronco pulmonar eram retirados integralmente. Depois de tirar o conjunto da carcaça, o mesmo era totalmente lavado com solução salina estéril. Os cotos dos vasos e os átrios eram secos, com gaze, para que fosse removido o excesso de líquido. O conjunto era, então, colocado sobre uma toalha e fotografado. A prótese era inspecionada através da inspeção usual e leve palpação. Após o coração ter sido removido da carcaça, os pulmões, o fígado, os rins e o cérebro eram removidos, um de cada vez, e examinados em fatias múltiplas. Secções múltiplas do cérebro eram inspecionadas e quaisquer lesões observadas, registradas no relatório de necropsia. Os órgãos remanescentes eram apenas inspecionados e, quaisquer lesões, eram registradas no relatório de necropsia. Todos os cortes dos órgãos eram colocados em solução neutra tamponada com 10% de formalina para fixação. Um relatório da necropsia era escrito depois de completa a dissecção da carcaça. 4. Dissecção do coração e da bioprótese Toda a superfície dos átrios, ventrículos, vasos, endotélio, do miocárdio e da artéria pulmonar foi examinada e inspecionada detalhadamente . Quaisquer lesões ou alterações observadas eram 40 Métodos registradas. Foram coletadas amostras para bacteriologia com swabs. A prótese com suas extensões foram fotografadas e imersas para fixação em uma solução neutra tamponada com 10% de formalina. G – Radiologia As amostras foram submetidas ao estudo radiológico para determinação da distribuição e intensidade dos depósitos de cálcio nos folhetos valvulares, bem como no tubo. Foi utilizado um mamógrafo Senographe DMR (GE, Buc. França) com voltagem de aceleração em 22kV. O grau de calcificação foi classificado de zero a três (0 a 3), de acordo com o método de Grabenwöger (GRABENWÖGER et al, 1992), que se baseia na quantidade de cálcio detectada pela radiografia, considerando o folheto valvular e o tubo. H - Espectrofotometria por absorção atômica Fragmentos do tubo e das cúspides foram desidratados em estufa a 50oC e mineralizados em forno de Mufla a 800oC. As amostras mineralizadas foram dissolvidas em ácido nítrico (HNO3 - 2,5M) determinado-se a quantidade de cálcio (expressa em ug/mg de tecido seco) pelo método da espectrofotometria de absorção atômica, através do espectrofotômetro Perkin Elmer de 1,000mg/L com adição de cloreto de latânio a 1% (BAUCIA et al, 2006). 41 Métodos I - Análise estatística Os dois grupos foram comparados quanto aos dados da angiografia, medidas hemodinâmicas, macroscopia, microscopia, radiologia e espectofotometria por absorção atômica. Todos os dados categóricos estão expressos em proporções, enquanto que as variáveis quantitativas estão expressas em média ± desvio padrão. Foram construídos histogramas para avaliar a distribuição normal dos dados quantitativos. Optou-se por utilizar o teste exato de Fisher para comparar as frequências observadas no Grupo L-HydroR (grupo teste) com as frequências observadas no Grupo Glutaraldeído (grupo controle). Para comparar os dados quantitativos entre os grupos (casos versus controles), escolheu-se o teste T de Student ou o teste de Mann-Whitney, quando apropriado. O nível de significância foi pré-estabelecido em 5%. O softwareR utilizado foi o SPSS na sua versão 2008. RESULTADOS 43 Resultados Dezenove animais foram submetidos ao procedimento de substituição do tronco pulmonar por enxerto tubular valvado. A mortalidade operatória foi de 10,53% (dois animais). A causa da mortalidade foi choque hipovolêmico secundário a sangramento intra operatório. Os dezessete animais restantes foram incluídos no estudo. O Quadro 01 resume as informações relacionadas ao estudo. QUADRO 01: Dados cirúrgicos GÊNERO PESO IDADE CEC Sobrevida TAMANHO (Kg) (meses) (min) (dias) PRÓTESE STATUS GRUPO L-HydroR 1 F 34 8,13 76 165 17 Óbito 2 M 30 7,93 93 197 17 Sacrificado 3 F 35 6,77 79 194 17 Sacrificado 4 M 30 6,13 76 151 17 Sacrificado 5 M 27 6,20 62 168 15 Sacrificado 6 M 30 7,37 100 174 17 Sacrificado 7 M 35 6,73 49 162 17 Sacrificado 8 M 35 6,73 71 162 17 Sacrificado 9 M 33 6,60 48 86 17 Óbito 10 M 33 6,67 28 161 17 Sacrificado 11 M 32 6,77 34 161 17 Sacrificado 12 M 32 6,77 30 162 17 Sacrificado 16 F 30 7,67 39 154 19 Sacrificado 17 M 28 8,33 35 154 19 Sacrificado GÊNERO PESO IDADE CEC Sobrevida TAMANHO (Kg) (meses) (min) (dias) PRÓTESE STATUS GRUPO Glutaraldeído 13 M 35 6,30 38 161 17 Sacrificado 14 M 33 6,30 30 161 17 Sacrificado 15 M 33 6,50 25 161 17 Sacrificado No Grupo L-HydroR, dois animais morreram antes do sacrifício. O primeiro, no 86o dia de pós operatório, teve como causa mortis endocardite, 44 Resultados confirmada por necrópsia. Clinicamente, aquele animal havia apresentado febre nos dias que antecederam sua morte. Conforme definido pelo protocolo da pesquisa, foi isolado dos demais animais e recebeu tratamento antibiótico por seis dias. O segundo animal foi encontrado morto no 165o dia de pós operatório, enquanto aguardava o sacrifício. Clinicamente o animal apresentava febre e hipoatividade. Leucograma dosado na véspera do óbito revelou leucocitose importante (20.100/mm3) sem desvio. Necropsia não mostrou evidência de endocardite. Havia, entretanto, sinais de infecção respiratória no pulmão direito (congestão e edema). As Figuras 2 e 3 mostram o aspecto final, pós implante, dos Grupos L-HydroR e Glutaraldeído, bem como a verificação dos parâmetros hemodinâmicos por catéter tipo jelco e pelo catéter de Swan-Ganz, pós implante e no sacrifício, respectivamente, de ambos os grupos. A B FIGURA 2 - A) Aspecto final pós implante Grupo L-HydroR; B) Aspecto final pós implante Grupo Glutaraldeído 45 Resultados B A FIGURA 3 - A) Verificação dos parâmetros hemodinâmicos por catéter (pós implante); B) Verificação dos parâmetros hemodinâmicos por SwanGanz (sacrifício). Todos os animais foram submetidos à avaliação laboratorial no préoperatório, no sétimo dia de pós operatório (PO), no nonagésimo PO e antes do sacrifício. Os resultados desses exames não demonstraram alterações significantes. Os dados com os resultados destes exames encontram-se relacionados no Anexo 3. 1. Avaliação Hemodinâmica Na cirurgia de implante das próteses, no Grupo L-HydroR, a média das pressões médias de ventrículo direito (PMVD) foram de 13,7 (+/-5,0), enquanto que no Grupo Glutaraldeído a média das PMVD foi de 10,0 (+/-2,2) (p= 0,259) - (Figura 4). Em relação à média das pressões médias da artéria pulmonar (PMAP) foi de 13,1 (+/-6,5) no Grupo L-HydroR, e de 7,3 (+/-1,2) no Grupo Glutaraldeído (Figura 5). 46 Resultados 13,69 10 Grupo L-Hydro Grupo Glutaraldeído FIGURA 4: PMVD Grupos L-HydroR e Glutaraldeído (pós implante) 13,13 7,33 Grupo L-Hydro Grupo Glutaraldeído FIGURA 5: PMAP Grupos L-HydroR e Glutaraldeído (pós implante) A média dos gradientes VD-AP foi de 10,0 (+/-7,6) no Grupo LHydroR e 10,67 (+/-1,2) no Grupo Glutaraldeído (p= 0,788), conforme demonstrado na Figura 6. 47 Resultados 10 10,67 Grupo L-Hydro Grupo Glutaraldeído FIGURA 6: Gradiente VD-AP - Grupos L-HydroR e Glutaraldeído Os valores médios da pressão sistólica da artéria pulmonar (PSAP), após o implante do enxerto (PSAP1) foram de 24,4mmHg (+/-11,7) no Grupo L-HydroR e de 13,3mmHg (+/-2,9) no grupo Glutaraldeído (p=0,036). Já no sacrifício, a média da PSAP (PSAP2) foi de 13,6mmHg (+/-7,6) no Grupo L-HydroR e de 17,7mmHg (+/-3,5) no Grupo Glutaraldeído (p= 0,070). Ver Figuras 7 e 8. A variação da PSAP entre os grupos foi significante (p= 0,030), de acordo com a análise estatística de Mann-Whitney. 50,0 37,5 25,0 12,5 0 PSAP1 PSAP2 01 08 02 09 03 10 04 11 05 12 06 16 07 17 FIGURA 7: PSAP1 X PSAP2 - Grupo L-HydroR 48 Resultados 30,0 22,5 15,0 7,5 0 PSAP1 PSAP2 13 14 15 FIGURA 8: PSAP1 X PSAP2 - Grupo Glutaraldeído Já a média das pressões médias do ventrículo direito (PMVD1) no Grupo L-HydroR, após o implante do enxerto, foi de 13,7mmHg (+/-5,0), enquanto que antes do sacrifício (PMVD2) foi de 15,8mmHg (+/-6,0). No Grupo Glutaraldeído, a média das PMVD1, após o implante das próteses, foi de 10,0mmHg (+/-2,2), enquanto que antes do sacrifício a média das PMVD2 foi de 17,5mmHg (+/-5,1) (Figuras 9 e 10). 30,0 22,5 15,0 7,5 PMVD1 PMVD2 1 8 2 9 3 10 4 11 5 12 6 16 7 17 FIGURA 9: PMVD1 X PMVD2 - Grupo L-HydroR 49 Resultados 30,0 22,5 15,0 7,5 0 PMVD1 PMVD2 13 14 15 FIGURA 10: PMVD1 X PMVD2 - Grupo Glutaraldeído Não houve significância na comparação dos dados inter grupos: Implante (p= 0,259) / Sacrifício (p= 0,666), assim como na análise de variação da PMVD (p= 0,546). O gradiente sístolico (VD-AP) nos animais do Grupo L-HydroR variou após o implante do enxerto, entre zero e 19mmHg, média de 10,0mmHg (+/-7,6), enquanto que no Grupo Glutaraldeído esse gradiente variou de 10 a 12, média de 10,7mmHg (+/-1,2) (p= 0,788). Já antes do sacrifício, o gradiente sistólico (VD-AP) variou no Grupo L-HydroR entre hum e 23mmHg, média de 10,4mmHg (+/-7,6) e no Grupo Glutaraldeído entre 4 e 8mmHg, média de 6,0mmHg (+/-2,0) (p= 0,346 ). Ver Figuras 11 e 12. Não houve significância na análise de variação do gradiente sistólico VD-AP entre os Grupos L-HydroR e Glutaraldeído (p= 0,288). 50 Resultados 30,0 22,5 15,0 7,5 0 GRAD VD-AP1 GRAD VD-AP2 01 08 02 09 03 10 04 11 05 12 06 16 07 17 FIGURA 11: GRAD. VD-AP1 X GRAD. VD-AP2 - Grupo L-HydroR 12 9 6 3 0 GRAD VD-AP1 GRAD VD-AP2 13 14 15 FIGURA 12: GRAD. VD-AP1 X GRAD. VD-AP2 - Grupo Glutaraldeído Ainda em relação ao perfil hemodinâmico, a PAM variou no Grupo L-HydroR entre 85 e 137mmHg, média de 118,1mmHg (+/-17,0) e no Grupo Glutaraldeído entre 119 e 131, média de 126,3mmHg (+/-6,4) (p= 0,267). Ver Figura 13. 51 Resultados 118,1 Grupo L-Hydro 126,3 Grupo Glutaraldeído FIGURA 13: Média da PAM - Grupos L-HydroR e Glutaraldeído A PCP variou no Grupo L-HydroR entre zero e 9 mmHg, média de 5,7mmHg (+/-2,5) e no Grupo Glutaraldeído, entre 6 e 11, média de 8,3mmHg (+/-2,5) (p= 0,327). Ver Figura 14. 5,7 Grupo L-Hydro 8,3 Grupo Glutaraldeído FIGURA 14: Média da PCP - Grupos L-HydroR e Glutaraldeído Já o débito cardíaco médio (DCM) variou no Grupo L-HydroR entre 3,6 e 5,0 mmHg, média de 4,8mmHg (+/-1,5) e no Grupo Glutaraldeído, entre 4,5 e 7,8mmHg, média de 4,7mmHg (+/-0,3) - (p=0,484). Figura 15. 52 Resultados 4,82 4,71 Grupo L-Hydro Grupo Glutaraldeído FIGURA 15: Média do DCM - Grupos L-HydroR e Glutaraldeído As Tabelas 1 e 2 mostram as medidas hemodinâmicas obtidas por ocasião do sacrifício dos animais. TABELA 1: Medidas hemodinâmicas (sacrifício) GRUPO L-HydroR PVC PSVD PDVD PMVD 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 16 17 NA 1 0 0 1 2 2 1 NA 1 2 0 2 5 NA 38 12 22 31 23 13 17 NA 32 22 22 32 24 NA 7 0 3 6 4 7 0 NA 12 15 12 18 9 NA 22,5 5,5 12,5 18,5 13,5 10 8,5 NA 22 18,5 17 25 16,5 PSVD 18 29 24 PDVD 6 15 13 PMVD 12 22 18,5 GRUPO Glutarald. PVC 13 0 14 2 15 3 PSAP PDAP PMAP Grad S (VD-AP) NA 36 10 17 10 12 12 8 NA 9 16 8 14 11 NA 33 4 7 6 7 9 4 NA 4 8 5 10 9 NA 34 7 12 8 10 11 0 NA 7 12 7 13 10 NA 2 2 5 21 11 1 9 NA 23 6 14 18 13 PSAP PDAP PMAP Grad S (VD-AP) 14 9 12 4,0 21 18 20 8,0 18 15 17 6,0 PVC: Pressão venosa central / PSVD: Pressão sistólica do ventrículo direito / PDVD: Pressão diastólica do ventrículo direito / PMVD: Pressão média do ventrículo direito / PSAP: Pressão sistólica da artéria pulmonar / PDAP: Pressão diastólica da artéria pulmonar / PMAP: Pressão média da artéria pulmonar / Grad S(VD-AP): Gradiente sistólico (ventrículo direito-artéria pulmonar). NA: Não avaliada. 53 Resultados TABELA 2: Medidas hemodinâmicas (sacrifício) GRUPO L-HydroR 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 16 17 PCP NA NA 8 5 7 5 7 0 NA 3 6 7 6 9 PAS NA 99 139 126 144 152 118 146 NA 145 139 124 138 163 PAD NA 68 102 101 106 116 92 110 NA 114 100 96 91 129 PAM NA 85 122 114 122 137 95 127 NA 129 118 112 109 147 DC 1 NA 4,33 3,77 3,73 5,25 4,79 4,1 5 NA NA 4,39 4,26 7,84 7,83 DC2 NA 4,14 3,77 4,09 3,81 5,19 3,58 4,8 NA NA 3,16 4,03 8,73 7,96 DC3 NA 4,06 3,64 3,57 4,52 4,75 3,72 5,21 NA NA 3,34 4,77 7,5 5,56 DCM NA 4,18 3,73 3,80 4,53 4,91 3,80 5,00 NA NA 3,63 4,35 8,02 7,12 GRUPO Glutarald. PCP PAS PAD PAM DC 1 DC2 DC3 DCM 13 14 15 8 11 6 157 175 148 116 100 106 131 129 119 4,63 4,26 4,25 4,81 4,54 4,74 4,46 6,16 4,55 4,63 4,99 4,51 PCP: Pressão capilar pulmonar / PAS: Pressão arterial sistólica / PAD: Pressão arterial diastólica / PAM: Pressão arterial média / DC1: Débito cardíaco (primeira medida) / DC2: Débito cardíaco (segunda medida) / DC3: Débito cardíaco (terceira medida) / DCM: Débito cardíaco médio. NA: Não avaliada. A análise estatística das pressões obtidas na cirurgia do implante da prótese mostraram significância apenas na avaliação das pressões sistólicas de artéria pulmonar. Nessa variável, inclusive, a variação das PSAP entre os Grupos L-HydroR e Glutaraldeído também mostrou significância, conforme resumido na Tabela 3. Apesar disso, podemos afirmar que, do ponto de vista de comportamento hemodinâmico, ambas as próteses (preservadas em L-HydroR ou Glutaraldeído), possuem perfis semelhantes. 54 Resultados TABELA 3: Análise estatística variáveis quantitativas (hemodinâmica). Grupo L-HydroR (n=14) Grupo Glutaraldeído (n=3) Valor de p† PAM (sacrifício) 117(+/- 15) 129(+/- 19) 0,267 PVC 1,0(+/- 1,6) 1,7(+/- 1,5) 0,336 PCP (sacrifício) 5,9(+/- 2,8) 7,7(+/- 1,5) 0,327 PSAP (cirurgia) 24,4(+/-10,9) 13,3(+/-2,9) 0,036 PSAP (sacrifício) 13,6(+/- 7,6) 17,7(+/- 3,5) 0,070 Variação PSAP 9,7(+/- 8,7) -4,3(+/- 6,1) 0,030 PMVD (cirurgia) 13,7(+/- 5,0) 10,0(+/- 2,2) 0,259 PMVD (sacrifício) 15,8(+/- 6,0) 17,5(+/- 5,1) 0,666 Variação PMVD -4,4(+/- 7,2) -7,5(+/- 6,8) 0,546 Gradiente sistólico VD-AP (cirurgia) 9,9(+/- 7,8) 10,7(+/- 1,2) 0,788 Gradiente sistólico VD-AP (sacrifício) 10,4(+/- 7,6) 6,0(+/- 2,0) 0,346 Variação gradiente sistólico VDAP -1,2(+/- 8,7) 4,7(+/- 2,3) 0,288 DCM 4,8(+/- 1,5) 4,7(+/- 0,25) 0,484 Variável* Variáveis quantitativas *Dados em média / desvio-padrão — variáveis quantitativas †Teste t de Mann-Whitney (variáveis quantitativas) 55 Resultados 4. Avaliação Angiográfica A angiografia verificou as seguintes variáveis: a. Contratilidade do ventrículo direito; b. Obstrução da via de saída do ventrículo direito; c. Estenose valvar pulmonar; d. Refluxo valvar pulmonar; e. Estenose da artéria pulmonar; f. Refluxo tricúspide. No momento da cirurgia de implante do tubo valvado, a contratilidade do ventrículo direito estava preservada em todos os animais. Do mesmo modo, não foi verificada obstrução da VSVD, estenose pulmonar valvar ou refluxo tricúspide em qualquer dos animais. Apenas um animal apresentava discreto refluxo da válvula pulmonar. Um outro animal apresentava discreta estenose da artéria pulmonar. Do mesmo modo, no momento do sacrifício, apenas dois casos do grupo teste apresentaram redução discreta da contratilidade do ventrículo direito e apenas um caso do mesmo grupo apresentava discreta obstrução da via de saída do ventrículo direito (Tabela 4). 56 Resultados TABELA 4: Contratilidade do VD e obstrução da VSVD pela angiografia GRUPO L-HydroR 1 2 Contratilidade do VD (sacrifício) Obstrução VSVD (sacrifício) NA NA Preservada Não 3 Preservada Não 4 Diminuída Não 5 Preservada Discreta 6 Preservada Não 7 Preservada Não 8 Preservada Não 9 NA NA 10 Preservada Não 11 Preservada Não 12 Preservada Não 16 Preservada Não 17 Diminuída Não GRUPO Glutaraldeído Contratilidade do VD (sacrifício) Obstrução VSVD (sacrifício) 13 Preservada Não 14 Preservada Não 15 Preservada Não NA: Não avaliado No sacrifício, quatro animais do grupo teste apresentavam discreta estenose ao nível da válvula pulmonar. Não foi detectada estenose do tubo valvado em nenhum animal no momento do sacrifício (Tabela 5). Já a variável refluxo valvar demonstrou que seis animais do grupo teste e um do grupo controle apresentavam refluxo discreto, três apresentavam refluxo moderado (dois do grupo controle) e dois animais (do grupo teste) apresentavam refluxo importante. Três animais (dois do grupo teste) apresentavam refluxo tricúspide discreto. Em outros três (grupo teste), o refluxo era moderado (Tabela 6). Apesar disso, não houve significância na avaliação de refluxo valvar pulmonar (p= 0,242) e refluxo tricúspide (p= 1,0). 57 Resultados TABELA 5: Estenose valvar e estenose da AP pela angiografia GRUPO L-HydroR 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 16 17 GRUPO Glutaraldeído 13 14 15 Estenose Valvar (sacrifício) NA Discreta Não Não Discreta Não Não Discreta NA Discreta Não Não Não Não Estenose Valvar (sacrifício) Não Não Não Estenose AP (sacrifício) NA Não Não Não Não Não Não Não NA Não Não Não Não Não Estenose AP (sacrifício) Não Não Não TABELA 6: Refluxo valvar pulmonar e refluxo tricúspide - angiografia GRUPO L-HydroR 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 16 17 GRUPO Glutaraldeído 13 14 15 Refluxo Valvar Pulmonar (sacrifício) NA Discreto Não Importante Discreto Importante Discreto Discreto NA Não Não Discreto Refluxo Tricúspide (sacrifício) NA Moderado Discreto Não Não Moderado Não Não NA Não Não Não Discreto Moderada Refluxo Valvar Pulmonar (sacrifício) Moderada Moderada Discreto Discreto Moderado Refluxo Tricúspide (sacrifício) Discreto Não Não 58 Resultados 3. Avaliação Radiológica (mamografia) A detecção de calcificação, pela técnica mamográfica, das próteses preservadas em L-HydroR, limitou-se à zona de costura da prótese (Figuras 16 e 17). FIGURA 16: Aspecto radiológico de prótese preservada em L-HydroR Calcificação FIGURA 17: Aspecto radiológico de próteses preservada em glutaraldeído - setas indicando calcificação difusa. 59 Resultados Já nas próteses preservadas em glutaraldeído, essa calcificação ocorreu em todas as próteses e se estendeu à parede do tubo e das cúspides valvares. De acordo com a classificação de Grabenwöger (GRABENWÖGER et al, 1992), o caso 13 apresentou calcificação moderada (grau 2), os casos 14 e 15 apresentaram calcificação importante (grau 3) - (Tabela 7). TABELA 7: Mensuracão de calcificacão: 0- Ausência de calcificação; 1Calcificação leve; 2- Calcificação moderada; 3- Calcificacão importante. GRUPO L-HydroR Calcificação de folheto Calcificação do tubo mamografia mamografia 1 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 0 9 0 0 10 0 0 11 0 0 12 0 0 16 0 0 17 0 0 GRUPO Glutaraldeído Calcificação de folheto Calcificação do tubo mamografia mamografia 13 2 2 14 3 3 15 3 3 A análise estatística revelou diferença significante (p = 0,001) na comparacão entre os Grupos L-HydroR e Glutaraldeído, conforme demonstrado na Tabela 8. 60 Resultados TABELA 8: Análise estatística mamografia (Grupos L-HydroR e Glutaraldeído). Variável* Grupo L-HyroR Grupo Glutaraldeído (n=14) (n=3) Valor de p† Calcificação dos folhetos (mamog.) 0(0%) 3 (100%) 0,001 Calcificação do tubo (mamog.) 0(0%) 3 (100%) 0,001 *Dados em número absoluto (porcentagem) — variáveis categóricas †Teste do exato de Fisher 4. Avaliação Macroscópica A avaliação macroscópica das próteses foi realizada em todos os animais. Em quatro animais (Grupo L-HydroR), foi observada a presença de vegetação compatível com endocardite. Um desses animais foi encontrado morto no 86o PO. Apesar disso, não houve crescimento bacteriano que confirmasse a impressão macroscópica. Todas as próteses do Grupo Glutaraldeído mostravam calcificação macroscópica dos folhetos e do tubo. Em duas destas próteses a calcificação foi quantificada como severa. Já dentre as próteses do Grupo L-HydroR, duas (14,3%) demonstravam calcificação quantificada como leve, do tubo. Apenas em um dos folheto de uma das próteses foi verificada a presença de calcificação, quantificada como leve (Tabela 9). Outro achado verificado na avaliação macroscópica foi a aderência parcial ou total dos folhetos à parede do tubo. Isso ocorreu em 7 (50%) animais, todos do Grupo L-HydroR. Em três animais (21,4%), todos os folhetos da prótese estavam aderidos à parede do tubo. Dois animais 61 Resultados (14,3%) apresentavam hum dos folhetos aderidos e em outros dois animais (14,3%), dois folhetos encontravam-se aderidos à parede do tubo. Não havia sinais de aderência de folhetos à parede do tubo nos animais do Grupo Glutaraldeído. TABELA 09: Mensuracão de calcificacão: 0- ausência de calcificação; 1calcificação leve; 2- calcificação moderada; 3- calcificacão importante. Avaliação de aderência de folhetos (N: número de folhetos aderidos). GRUPO L-HydroR Calcificação de folheto Calcificação do tubo Aderência de folheto(s) - (N) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 16 17 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 3 0 0 2 0 0 1 1 3 0 3 2 0 0 GRUPO Glutaraldeído Calcificação de folheto 2 3 3 Calcificação do tubo 2 3 3 Aderência de folheto(s) - (N) 0 0 0 13 14 15 Nas variáveis calcificação de tubos e calcificação de folhetos houve significância (p= 0,001) na comparação entre os Grupos L-HydroR e Glutaraldeído. Já na variável aderência de folhetos, essa diferença 62 Resultados estatística não foi observada (p= 0,228), conforme demonstrado na Tabela 10. TABELA 10: Análise estatística da macroscopia (Grupos L-HydroR e Glutaraldeído) Grupo L-HydroR (n=14) Grupo Glutaraldeído (n=3) Valor de p† Calcificação das cúspides (macroscopia) 0(0%) 3(100%) 0,001 Calcificação do tubo (macroscopia) 0(0%) 3(100%) 0,001 Aderência dos folhetos (microscopia) 7(50%) 0(0%) 0,228 Variável* *Dados em número absoluto (porcentagem) — variáveis categóricas †Teste do exato de Fisher (variáveis categóricas) As Figuras 18 e 19 mostram o aspecto macroscópico das próteses explantadas (Grupo L-HydroR e Glutaraldeído). A B FIGURAS 18 - Aspecto macroscópico pós explante: A) Tubo Grupo LHydroR; B) Tubo Grupo Glutaraldeído. 63 Resultados B A FIGURAS 19 - Aspecto macroscópico pós explante: A) Cúspides Grupo LHydroR; B) Cúspides Grupo Glutaraldeído. As Figuras 20 e 21 mostram o aspecto macroscópico das próteses explantadas do Grupo L-HydroR, que apresentavam aderência parcial ou total dos folhetos à parede do tubo. Cúspides íntegras Ausência de folheto (aderência) FIGURAS 20 - Aspecto macroscópico pós explante - Aderência parcial de cúspide à parede do tubo - Grupo L-HydroR. 64 Resultados Ausência das cúspides FIGURAS 21 - Aspecto macroscópico pós explante - Aderência total das cúspides à parede do tubo Grupo L-HydroR. 5. Avaliação Microscopia Ótica A avaliação microscópica foi realizada em 16 animais, sendo 13 do Grupo L-HydroR e três do Grupo Glutaraldeído (Tabela 11). A coloração pelo método hematoxilina-eosina mostrou sinais de calcificação nas cúspides de sete dos 13 animais do Grupo L-HydroR (53,8%), bem como no tubo de dez dos 13 animais deste mesmo grupo (77%). Essa calcificação, entretanto foi quantificada como leve em todos os casos. Nenhum animal do Grupo L-HydroR teve calcificação moderada ou severa de suas cúspides ou tubo (Figuras 22, 23 e 24). 65 Resultados TABELA 11: Mensuracão de calcificação: 0- ausência de calcificação; 1calcificação leve; 2- calcificação moderada; 3- calcificacão importante. GRUPO L-HydroR Calcif. folheto Calcif. tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 16 17 GRUPO Glutaraldeído NA 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 1 0 Calcif. folheto NA 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 Calcif. tubo 13 14 15 3 3 3 3 3 3 NA: Não avaliada Pontos isolados de calcificação FIGURA 22: Aspecto microscópico das próteses preservadas em L-HydroR (coloração em hematoxilina-eosina), mostrando, em lilás, os pontos isolados de calcificação. 66 Resultado Pontos isolados de calcificação FIGURA 23: Aspecto microscópico das próteses preservadas em L-HydroR (coloração em hematoxilina-eosina), mostrando, em lilás, os pontos isolados de calcificação. Pontos isolados de calcificação FIGURA 24: Aspecto microscópico das próteses preservadas em L-HydroR - coloração em hematoxilina-eosina Em lilás, os pontos isolados de calcificação. 67 Resultado A avaliação microscópica dos animais do Grupo Glutaraldeído mostrou calcificação importante de todas as cúspides e fragmentos de tubo avaliados. A microscopia mostrou, ainda, processo inflamatório macrofágico com depósitos fibrinóides e ausência de trombos ou coágulos nas amostras analisadas de ambos os Grupos (Figuras 25). FIGURAS 25: Aspecto microscópico (microscopia ótica) das próteses preservadas em glutaraldeído - coloração em hematoxilina-eosina. Em lilás, regiões de calcificação difusa e severa (setas). 68 Resultado A análise estatística dos resultados demonstra diferença significante (p=0,001) nas variáveis calcificação de cúspides e de tubo na comparação entre os Grupos L-HydroR e Glutaraldeído - (Tabela 12). TABELA 12: Análise estatística microscopia (Grupos L-HydroR e Glutaraldeído) Grupo L-HydroR (n=14) Grupo Glutaraldeído (n=3) Valor de p† Calcificação das cúspides (microscopia) 0(0%) 3(100%) 0,001 Calcificação do tubo (microscopia) 0(0%) 3(100%) 0,001 Variável* *Dados em número absoluto(porcentagem)- †Teste exato de Fisher (variáveis categóricas) 6. Espectrofotometria de Absorção Atômica A dosagem de cálcio por espectrofotometria de absorção atômica demonstrou maior concentração de cálcio nas próteses preservadas em glutaraldeído, quando comparadas àquelas preservadas em L-HydroR. A análise estatística dos dados demonstraram diferença significante quanto à dosagem de cálcio, quando comparados os Grupo L-HydroR e Glutaraldeído (p= 0,017). A Tabela 13 mostra os valores obtidos a partir dessa técnica. 69 Resultado TABELA 13: Dosagem de Cálcio (ug/mg) por espectrofotometria de absorção atômica. GRUPO L-HydroR Abs. Atômica 1 43,84 2 139,44 3 48,7 4 14,2 5 25,7 6 240,9 7 206,6 8 98,3 9 58,39 10 53,76 11 38,97 12 22,4 16 64,04 17 50,01 GRUPO Glutaraldeído Abs. Atômica 13 318,3 14 193,32 15 720,3 (p = 0,017) †Teste t de Mann-Whitney (variáveis quantitativas) DISCUSSÃO 71 Discussão O uso de substitutos valvares para tratamento de doenças que acometem as valvas cardíacas datam da década de 60 do século passado. Essa modalidade terapêutica tem conferido melhora da qualidade de vida e da própria sobrevida dos pacientes, quando comparada ao tratamento clínico. O desenvolvimento de método de preservação deve contemplar também mecanismo confiável de esterilização, manutenção das propriedades mecânicas e prevenção da desnaturação do colágeno, bem como das reações imunológicas, a partir da formação de compostos antigênicos. Tais fatores, aliás, respondem em grande proporção pelo processo de calcificação das próteses, sobretudo, daquelas preservadas em glutaraldeído. O implante de próteses valvares biológicas que permitam e promovam o revestimento espontâneo com células do hospedeiro foi proposta por FRATER et al. (1992) e é o princípio que embasou o desenvolvimento da preservação em L-HydroR, utilizada neste estudo. A pesquisa em torno desse assunto tem mobilizado estudiosos na busca por métodos que diminuam as reações adversas citadas acima. Neste contexto, o glutaraldeído, além de ser um dos primeiros compostos utilizados na preservação de próteses valvares biológicas, é também o mais usado na prática clínica atualmente (GRABENWÖGER et al., 1996; VICENTELLI et al., 1998; MIRZAE et al., 2000). 72 Discussão No presente estudo, utilizou-se como agente de preservação o LHydroR em tubo valvado de pericárdio bovino, implantado na via de saída do ventrículo direito de carneiros. Esses animais têm sido utilizados por diversos autores e possuem a característica de serem dóceis e permitirem o fácil manejo durante todo o período de teste. Por se tratar de animal de grande porte e por possuir crescimento e desenvolvimento rápido, as alterações fisiopatológicas se assemelham àquelas que ocorrem no homem durante a vida. O tempo de, pelo menos 150 dias, foi necessário para que o carneiro apresentasse seu desenvolvimento pôndero-estatural adequado compativel com a vida adulta (GREHAN et al., 2001) podendo-se constatar ou não a ocorrência de calcificação, assim como analisar, nesse tipo de bioprótese, o desempenho hemodinâmico da mesma, tanto quanto seu desgaste. O comportamento intra-operatório não diferiu nos dois grupos, sendo que, o tempo de CEC e a baixa mortalidade (dois animais) demonstram a exequibilidade e reprodutibilidade do procedimento. Apesar de ter ocorrido discreto aumento na pressão média do ventrículo direito (PMVD) quando se comparou tais valores no momento do implante e antes do sacrifício dos animais, esse comportamento foi uniforme nos dois grupos. Os demais parâmetros hemodinâmicos tiveram o mesmo comportamento. Isso nos permite afirmar que o PEG manteve as propriedades do enxerto e, portanto, sua funcionalidade. A exemplo do demonstrado por SANTOS et al., em 2007, que testou a incidência de calcificação em próteses porcinas preservada em L-HydroR , implantada em posição aórtica de carneiros, comparando-as com próteses preservadas em 73 Discussão glutaraldeído, no presente estudo, não foram observadas diferenças no desempenho hemodinâmico das duas próteses. Ao contrário, NINA et al., 2003, ao analisar o comportamento hemodinâmico de próteses porcinas preservadas em L-HydroR e compará-las às preservadas em glutaraldeído, encontrou pressões capilares pulmonares maiores neste grupo, sendo esta diferença significante. No presente estudo, a avaliação angiográfica mostrou maior incidência de refluxo nas próteses do grupo L-HydroR quando comparadas ao grupo Glutaraldeído. Isso pode ser explicado pela ocorrência, no grupo teste, de aderência parcial ou total das cúspides à parede do tubo em 07/14 próteses (50%). As demais variáveis (estenose valvar ou do tubo, contratilidade ou obstrução da via de saída do VD, refluxo tricúspide), mostraram comportamento uniforme, Nenhuma das variáveis hemodinâmicas revelou diferença significante. A exemplo dos estudos de NINA et al., em 2003, SANTOS et al., em 2007 e REY et al., em 2011, a avaliação radiológica, no presente estudo, demonstrou diferença significante na verificacão de calcificação das próteses que tiveram preservação em L-HydroR, versus aquelas que foram preservadas em glutaraldeído. Essas últimas com maior grau de calcificação. Do mesmo modo, a exemplo desses estudos, a avaliação macroscópica e microscópica demonstraram maior grau de calcificação nas biopróteses preservadas em glutaraldeído. A avaliação macroscópica analisou a presença de pontos de calcificação, o que foi verificado em todas as próteses do Grupo Glutaraldeído. Macroscopicamente, apenas uma das 74 Discussão cúspides do Grupo L-HydroR apresentava calcificação quantificada como leve. Não foi observada a presença de trombos em nenhum dos grupos. Ao contrário, REY et al. (2011) encontraram trombo em cúspide e no seio de Valsalva de homoenxertos preservados em L-HydroR. Em relação à microscopia, os resultados demonstram maior calcificação das próteses preservadas em glutaraldeído, assim como os estudos de NINA et al. (2003) e SANTOS et al. (2007). No caso das próteses preservadas em L-HydroR, NINA et al. (2003), constataram, através da microscopia eletrônica de varredura, a formação de um novo endotélio, resistente à insudação de proteínas plasmáticas e sais, que são precursoras da degeneração bioprotética. Em suas observações, NINA et al. (2003) concluíram que a ausência de toxicidade, característica da preservação em L-HydroR, permitiu que a matriz das próteses do grupo teste se tornasse biocompatível, possibilitando a reendotelização espontânea, favorecendo maior resistência à calcificacão e trombogenicidade. Através da microscopia eletrônica de varredura e da microscopia eletrônica de transmissão, REY et al., (2011) demonstraram evidência histológica de repopulação intersticial e endotelial, na superfície de homoenxertos preservados em L-HydroR, implantados em carneiros. É atribuída ao PEG a propriedade imunossupressora, na qual se fundamenta a preservação L-HydroR. Conforme demonstrado por COLLINS et al. (1991), antígenos que se combinam com o PEG, apresentam redução da antigenicidade. WICOMB et al., (1992) demonstraram a reduzida toxicidade do PEG, quando adicionaram essa substância à solução de preservação miocárdica, garantindo viabilidade ao 75 Discussão órgão por tempo mais prolongado, quando comparadas às soluções cardioplégicas convencionais. Outros estudos tentaram mostrar essa mesma capacidade de endotelização. GOLDSTEIN et al. (2000) demonstraram a descelularização de heteroenxertos e homoenxertos associada à endotelização autógena in vitro. SHINOKA et al. (1995), propuseram a construção de prótese por meio da semeadura de células endoteliais e fibroblastos de ovinos sobre esqueleto polimérico biodegradável formado por fibras de ácido poliglicólico e poliglactina. Esse estudo mostrou evidência de crescimento endotelial. Apesar disso, as próteses apresentaram alta porosidade e rigidez, o que limitava sua aplicabilidade clínica. Constatou-se a ocorrência de aderência de parte ou de todas as cúspides das próteses do Grupo L-HydroR (sete animais), em comparação ao Grupo Glutaraldeído, onde esse evento não foi verificado. Uma possível explicação para tal aderênca é o fato das biopróteses preservadas em LHydroR terem, desde sua preparação, uma característica menos espessa e mais flexível, se comparadas às próteses preservadas em glutaraldeído. Sendo a via de saída do ventrículo direito uma zona de baixa pressão, as cúspides mais flexíveis estariam suceptíveis a aderirem à parede do tubo. A alteração do desenho da prótese com a confecção de seios imediatamente acima do plano valvar poderia, talvez, reduzir a incidência das aderências. Nesse sentido, estudos posteriores, testando esse novo modelo de prótese, permitiriam a avaliação do seu desempenho. REY et al., (2011), em seu estudo experimental com homoenxertos preservados em L-HydroR , 76 Discussão encontraram, a partir da microscopia óptica, cúspides pouco retraídas, com adelgaçamento progressivo em direção à borda livre. A espectrofotometria por absorção atômica, assim como as avaliações macro e microscópica, demostraram maiores concentrações de cálcio nas próteses do Grupo Glutaraldeído. Houve significância, o que comprova a viabilidade na avaliação de cálcio por esse método (BAUCIA et al., 2006). Apesar de não ter sido alvo desse estudo, a busca por um substituto valvar ideal ainda esbarra na dificuldade de identificar uma prótese que, além de ampliar sua durabilidade, seja capaz de acompanhar o crescimento do hospedeiro. Recentemente, FURLANETTO et al. (2009) demonstraram que xenoenxerto valvado pulmonar porcino, com preservação L-HydroR, colocado em posição pulmonar de carneiros recém nascidos e acompanhados até a fase adulta, apresentavam crescimento do enxerto, ausência de calcificacão e preservação da função valvar pulmonar. O presente estudo apresenta como limitação a impossibilidade de reproduzir o efeito da doença cardíaca e o perfil de coagulação comparável ao do homem, a exemplo de outros que utilizaram animais de grande porte na avaliação de novas tecnologias de preservação ou substituição de tecidos cardíacos (LEVY, 1994; SCHOEN, 1999). Ademais, os modelos animais, apesar da anatomia semelhante à humana, possuem antigenicidade diferente, o que pode levar a resultados não reprodutíveis quando do uso clínico (LOPES et al., 2011). 77 Discussão Ainda como fator limitante desse estudo, o número de animais alocados no Grupo Glutaraldeído (controle), apesar de se justificar pelo amplo conhecimento acerca da evolução e desfecho das próteses preservadas por este método, restringe a comparação entre os grupos nas variáveis hemodinâmicas, onde houve comportamento semelhante entre os grupos L-HydroR e Glutaraldeído. No presente estudo, a substituição do tronco pulmonar por enxerto tubular valvado com preservação em L-HydroR mostrou-se adequado para avaliação, como modelo experimental já que permite analogia ao que possa ocorrer com a espécie humana. A preservação com L-HydroR indicou redução significativa da calcificação no tubo e nas cúspides da bioprótese utilizada. Novas avaliações de desempenho deverão ser realizadas, a partir deste estudo, visando a observação e aplicabilidade clínica. A comprovação quanto à existência e viabilidade de repopulação tecidual e instersticial poderá ser obtida através de estudos complementares. CONCLUSÕES 79 Discussão As próteses preservadas em L-HydroR (não aldeídicas) mostraram-se mais resistente ao processo de degeneração tecidual, especialmente à calcificação, quando comparadas àquelas preservadas em glutaraldeído. REFERÊNCIAS 81 Referências Abolhoda A, Yu S, Oyarzun JR, McCormick JR, Bogden JD, Gabbay S. Calcification of bovine pericardium: glutaraldehyde versus No-React biomodification. Ann Thorac Surg. 1996 Jul; 62(1): 169-74. Abolhoda A, Yu S, Oyarzun JR, Allen KR, McCormick JR, Han S, Kemp FW, Bogden JD, Lu Q, Gabbay S. No-react detoxification process: a superior anticalcification method for bioprostheses. Ann Thorac Surg. 1996 Dec; 62(6): 1724-30. Absolon KB, Hunter SW, Quattlebaum FW. 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Several techniques try to contain the degenerative process of bioprostheses. Objectives: To evaluate the process of calcification in vivo pulmonary valve heterografts preserved in non-aldehydic (L-HydroR). Methods: 17 sheep underwent replacement of the pulmonary artery valved tubular grafts of bovine pericardium. The animals were divided into two groups: Group L-HydroR (test / n = 14) and Group Glutaraldehyde (control / n = 3). About 150 days after implantation, angiography was performed, hemodynamic measurements and sacrifice. The mice were sacrificed and the prostheses subjected to a pathological study, radiological evaluation and measurement of calcium by atomic absorption spectrophotometry. Statistical analysis was obtained through the Fisher's exact test, Student's t or Mann-Whitney test (significance: 5%). Results: The angiographic and hemodynamic performance of prostheses tested was similar in both groups. Radiological evaluation, the macroscopic and microscopic measurement of serum calcium by atomic absorption spectrophotometry showed increased calcification of the prosthesis Glutaraldehyde Group, when compared to L-HydroR Group prosthesis (p =0.001). 07 animals in Group L-HydroR (50%) had adherence of the leaflets to the wall of the tube (p = 0.228). Conclusions: Prostheses preserved in LHydroR were more resistant to calcification when compared with Glutaraldehyde preserved. ANEXOS 104 Anexos Anexo 1: Carta do Comitê de Ética em Pesquisa - UNIFESP 105 Anexos Anexo 2: Planilha geral de animais GÊNERO PESO IDADE CEC Sobrevida (Kg) (meses) (min) PRÓTESE (dias) TAMANHO STATUS PRÓTESE GRUPO I 1 F 34 8,13 76 86 L1420080218PB345 17 Encontrado morto 2 M 30 7,93 93 197 L1420080317665 17 Sacrificado 3 F 35 6,77 79 194 L1420080317APB681 17 Sacrificado 4 M 30 6,13 76 151 L1420080317APB666 17 Sacrificado 5 M 27 6,20 62 168 L1420071203APB327 15 Sacrificado 6 M 30 7,37 100 174 L1420080331APB323 17 Sacrificado 7 M 35 6,73 49 162 L1420080331APB324 17 Sacrificado 8 M 35 6,73 71 162 L1420080317APB692 17 Sacrificado 9 M 33 6,60 48 165 L1420080331APB330 17 Encontrado morto 10 M 33 6,67 28 161 L1420080623APB995 17 Sacrificado 11 M 32 6,77 34 161 L1420080623APB957 17 Sacrificado 12 M 32 6,77 30 162 L1420080623APB502 17 Sacrificado 16 F 30 7,67 39 154 L1420080331APB120 19 Sacrificado 17 M 28 8,33 35 154 L1420080331APB117 19 Sacrificado PRÓTESE TAMANHO STATUS GÊNERO PESO IDADE CEC Sobrevida GRUPO II (Kg) (meses) (min) (dias) PRÓTESE 13 M 35 6,30 38 161 NA000258 17 Sacrificado 14 M 33 6,30 30 161 NA A000495 17 Sacrificado 15 M 33 6,50 25 161 NA A000125 17 Sacrificado 106 Anexos Anexo 3: Avaliação laboratorial (cirurgia, 7o PO, 90o PO, sacrifício) 7o dia 90o dia HEMOGLOBINA (g/dl) CIRURGIA sacrifício 1 11,1 13,3 2 14,7 12,8 13,8 3 11,4 11,4 11 4 11 15,1 12,1 5 9,9 11,9 11,6 6 10,4 7 12,8 8,2 11,9 10,5 8 12,2 8,6 12,5 11,6 9 14,2 8,9 11,5 10 13,1 9,7 13,3 13,6 11 11,7 7,6 12,9 11,9 12 11,3 8,5 11,5 11,9 13 9,8 9,1 10,7 12,7 14 7,6 10,1 12,4 9,1 15 12 8,8 11,8 11,9 16 13,7 10,2 10,6 12 17 14,6 9,9 15,8 14,2 LEUCÓCITOS (/mm3) CIRURGIA 7o dia 90o dia sacrifício 1 11.300 16.500 2 12.200 8.300 6.800 3 9.800 7.600 6.600 4 6.500 13.800 10.400 5 9.800 10.900 8.300 6 10.300 7 10.100 7400 7.800 6.100 8 7.000 6500 6.700 6.400 9 10.600 8900 20.100 10 9.300 6100 6.700 5.000 11 9.700 9000 13.500 5.700 12 11.100 9300 11.800 6.600 13 13.900 8200 6.900 8.500 14 9.500 6700 8.600 6.600 15 8.800 7400 9.800 7.500 16 6.400 5400 12.300 6.500 17 6.900 7000 5.200 4.700 12,4 8.600 107 Anexos BILIRRUBINA DIRETA CIRURGIA 1 0,10 7o dia 90o dia sacrifício 0,10 2 0,10 0,10 0,10 0,20 4 0,10 0,10 5 0,10 3 0,10 6 0,10 0,10 7 0,10 0,10 0,10 8 0,10 0,10 0,10 9 0,10 0,10 10 0,10 0,10 0,10 11 0,10 0,10 0,10 0,10 12 0,10 0,10 0,10 0,10 13 0,10 0,10 0,10 0,10 14 0,10 0,10 0,10 15 0,10 0,10 0,10 16 0,10 0,10 17 0,10 0,10 BILIRRUBINA TOTAL CIRURGIA 7o dia 1 0,20 0,10 90o dia sacrifício 0,20 2 0,20 0,20 0,30 0,30 4 0,20 0,20 5 0,30 3 0,20 6 0,20 0,30 7 0,20 0,30 0,20 8 0,20 0,20 0,20 9 0,20 0,20 10 0,30 0,20 0,30 11 0,30 0,20 0,20 0,20 12 0,20 0,20 0,20 0,30 13 0,20 0,20 0,20 0,20 14 0,20 0,20 0,20 15 0,20 0,20 0,20 16 17 0,20 0,20 0,20 0,30 0,20 108 Anexos 90o dia sacrifício 9,7 10,1 9,9 9,7 9,5 10,2 9,5 9,4 4 10,2 9,4 5 9,6 9,5 CALCIO CIRURGIA 1 2 3 7o dia 6 9,3 10,6 7 9,7 9,1 9,1 9,0 8 10,5 9,2 10,0 9,4 9 10,4 8,7 10 9,9 9,0 9,2 9,2 11 9,1 8,6 8,5 8,3 12 9,8 8,8 9,6 8,9 13 10,2 9,3 8,8 8,7 14 9,9 9,5 9,1 8,7 15 9,6 9,2 8,1 8,7 16 9,7 10,2 9,6 9,7 17 10,2 9,4 10,6 9,7 CPK (U/L) CIRURGIA 7o dia 90o dia sacrifício 1 121 115 2 231 107 144 3 219 111 275 4 175 106 80 5 368 133 418 6 155 7 221 86 200 225 8 87 114 302 234 9 107 108 10 96 137 155 11 182 77 126 227 12 127 77 182 174 13 102 54 246 134 14 155 195 165 326 15 149 132 149 217 16 205 270 17 229 207 59 272 217 109 Anexos FERRO (mcg/dl) CIRURGIA 1 294 7o dia 90o dia sacrifício 143 2 207 237 189 298 4 171 120 5 183 306 3 181 6 183 177 7 112 75 157 169 8 93 82 184 196 9 114 93 10 106 160 147 189 11 150 84 94 145 12 126 55 148 111 13 163 118 200 163 14 79 58 201 333 15 91 79 139 145 16 169 129 216 152 17 279 122 260 370 POTÁSSIO (mEq/L) CIRURGIA 7o dia 90o dia sacrifício 1 5,5 4,6 2 7,2 4,8 10,3 3 7,8 4,5 4,9 4 5,2 4,6 5 4,6 6 4,7 7 5,1 5,1 7,6 8 5,0 5,0 6,4 9 5,7 4,7 10 4,9 4,9 6,0 11 5,7 4,7 5,7 12 5,4 5,3 7,7 5,7 13 5,1 5,8 5,3 14 4,9 4,7 6,4 15 5,1 4,5 6,1 4,7 5,2 6,0 4,5 16 17 5,4 4,5 7,3 4,9 110 Anexos SÓDIO (mEq/L) CIRURGIA 1 143 7o dia 90o dia sacrifício 150 2 150 139 149 146 4 151 145 5 146 144 3 149 6 145 148 7 147 147 146 148 8 146 146 147 145 9 149 143 10 150 146 154 148 11 149 144 145 147 12 149 146 150 151 13 147 149 147 14 149 149 151 147 15 149 146 152 145 16 150 146 146 17 150 151 146 149 FOSFATASE ALCALINA (U/L) CIRURGIA 7o dia 90o dia sacrifício 1 430 657 2 676 905 694 3 459 449 260 4 1.376 491 5 536 435 6 406 474 7 363 161 314 184 8 465 178 683 414 9 403 196 10 420 201 502 371 11 199 159 471 169 12 299 160 376 189 13 742 172 795 571 14 805 230 1.053 277 15 564 191 494 394 16 273 202 300 17 533 319 589 143 111 Anexos PROTEÍNAS TOTAIS (g/dl) CIRURGIA 7o dia 90o dia sacrifício 1 7,6 2 6,7 7,1 3 7,1 7,6 4 6,9 7,0 6,8 5 7,4 7,2 7,5 6 7,1 7 6,4 6,1 6,4 6,9 8 6,2 4,7 6,4 6,2 9 6,0 5,4 10 6,7 5,4 6,2 6,6 11 5,8 5,2 6,7 7,4 12 6,1 5,2 6,1 6,2 13 6,3 6,2 6,6 14 6,1 6,3 6,0 6,7 15 5,9 5,4 5,9 6,3 16 7,0 5,8 7,1 7,4 17 6,2 6,0 7,8 7,8 TGP (U/L) CIRURGIA 7o dia 90o dia sacrifício 1 29 18 2 20 18 20 3 31 23 20 4 15 27 15 5 16 20 11 6 21 7 22 18 21 27 8 22 16 18 21 9 10 6 10 16 29 19 24 11 14 13 12 19 12 5 12 18 18 13 12 9 4 7 14 30 16 20 8 15 6 5 12 2 16 22 23 21 11 17 19 23 22 27 7,5 17 112 Anexos 7o dia 90o dia URÉIA (mg/dl) CIRURGIA sacrifício 1 61 80 2 47 74 49 3 52 63 50 4 45 62 44 5 46 55 47 6 55 7 37 34 44 41 8 39 29 54 37 9 46 44 10 42 27 53 41 11 40 28 47 35 12 34 24 55 38 13 50 38 46 23 14 38 42 43 32 15 50 27 54 31 16 42 44 30 37 17 80 48 42 50 HEMATÓCRITO (%) CIRURGIA 7o dia 90o dia sacrifício 1 31,2 44,3 2 36,3 35,8 41,3 3 32,2 32,3 31,7 4 29,6 43,6 34 5 24,6 33 36 6 23,9 7 35,8 24,3 34,4 25,4 8 26,5 18,5 28,2 30,9 9 24,5 14,2 22,9 10 32,3 22,3 32,3 37,1 11 30,2 18,6 29,9 24,2 12 40,8 23,6 31,9 28,7 13 38 25,5 32,6 34,2 14 35,7 27,5 36,1 36,2 15 28,8 21,3 27,2 30,1 16 46,4 29,7 36 38,8 17 36,7 33,7 46,7 39,4 51 30,3 113 Anexos 7o dia 90o dia PLAQUETAS (/mm3) CIRURGIA sacrifício 1 395.000 204.000 2 447.000 162.000 303.000 3 482.000 254.000 506.000 4 308.000 494.000 473.000 5 516.000 560.000 420.000 6 321.000 7 647.000 639.000 466.000 255.000 8 749.000 784.000 461.000 219.000 9 889.000 836.000 396.000 10 899.000 970.000 302.000 227.000 11 738.000 809.000 325.000 341.000 12 641.000 648.000 484.000 688.000 13 532.000 637.000 266.000 352.000 14 464.000 621.000 426.000 234.000 15 771.000 853.000 445.000 292.000 16 398.000 502.000 692.000 379.000 17 752.000 699.000 253.000 349.000 BILIRRUBINA INDIRETA CIRURGIA 7o dia 90o dia sacrifício 1 0,10 358.000 0,10 2 0,10 0,10 0,20 0,10 4 0,10 0,10 5 0,20 3 0,10 6 0,10 0,20 7 0,10 0,20 0,10 8 0,10 0,10 0,10 9 0,10 0,10 10 0,20 0,10 0,20 11 0,20 0,10 0,10 0,10 12 0,10 0,10 0,10 0,20 13 0,10 0,10 0,10 0,10 14 0,10 0,10 0,10 15 0,10 0,10 0,10 16 17 0,10 0,10 0,10 0,20 0,10 114 Anexos COLESTEROL TOTAL CIRURGIA 1 88 7o dia 90o dia sacrifício 80 2 81 64 3 66 46 48 4 59 69 70 57 60 5 6 55 7 75 49 70 68 8 76 50 53 54 9 78 51 10 96 59 55 66 11 52 48 29 60 12 69 59 47 57 13 62 54 46 60 14 73 54 59 69 15 59 51 44 46 16 65 53 71 93 17 102 75 100 CREATININA (mg/dL) CIRURGIA 7o dia 90o dia 1 0,9 0,9 2 0,8 0,9 1,0 3 1,0 0,9 1,0 4 0,9 1,1 1,1 5 0,6 0,8 0,3 6 0,7 7 0,9 1,0 0,9 0,9 8 0,5 0,7 0,5 0,7 9 0,9 1,0 10 0,9 0,8 0,6 1,0 11 0,8 0,7 0,8 1,0 12 0,9 0,8 1,0 0,9 13 0,9 0,9 0,8 1,1 14 0,9 0,8 0,8 0,6 15 0,6 0,8 0,7 1,0 16 0,5 0,8 0,7 0,9 17 0,7 0,5 0,2 0,9 sacrifício 0,8 115 Anexos 7o dia 90o dia GLICEMIA (mg/dl) CIRURGIA 1 59 54 2 56 61 56 3 79 64 71 4 58 70 67 5 62 65 29 6 62 7 67 80 49 8 76 105 51 9 66 86 10 64 79 39 11 88 80 38 12 62 69 25 22 13 58 46 31 32 14 71 82 51 15 66 80 35 16 sacrifício 42 44 50 58 69 44 93 DEHIDROGENASE LÁTICA (U/L) CIRURGIA 7o dia 1 590 608 2 492 613 615 3 658 846 984 4 321 425 313 5 438 531 6 428 497 7 740 582 492 8 735 565 538 9 664 523 10 657 607 458 11 785 447 1.169 12 786 462 468 413 13 498 461 480 14 682 619 450 15 784 519 525 450 157 327 390 1.058 579 598 17 16 17 458 90o dia sacrifício 116 Anexos 7o dia 90o dia FÓSFORO (mg/dl) CIRURGIA sacrifício 1 5,3 7,3 2 9,0 9,4 8,0 3 7,0 8,1 12,0 4 5,1 7,3 5 5,4 7,8 6 4,5 5,8 7 8,9 9,2 9,7 11,3 8 7,5 7,1 7,8 7,1 9 8,9 8,4 10 10,9 8,4 9,5 6,7 11 9,7 7,1 5,2 6,7 12 9,2 7,1 7,1 9,0 13 8,3 8,5 9,1 14 8,1 8,3 10,9 8,6 15 11,5 6,6 10,4 7,7 8,2 9,6 16 17 10,2 6,4 7,4 PROTEÍNA GLICOSILADA (micromol/L) CIRURGIA 7o dia 1 174 187 2 167 180 183 3 188 193 212 4 245 218 225 5 226 190 207 6 209 7 222 211 201 218 8 219 189 190 198 9 220 210 10 219 205 203 216 11 165 167 178 196 12 172 164 192 194 13 189 183 188 14 211 219 199 200 15 200 186 200 16 273 17 221 90o dia sacrifício 165 184 202 300 194 235 117 Anexos 7o dia 90o dia TGO (U/L) CIRURGIA sacrifício 1 123 134 2 103 93 150 3 172 189 251 4 79 76 52 5 88 82 90 6 127 7 129 160 87 70 8 125 213 114 77 9 103 108 10 109 346 139 11 173 141 138 12 132 116 93 79 13 118 97 116 14 148 135 110 108 15 138 146 115 94 16 69 190 80 51 17 92 329 104 132 TRIGLICÉRIDES (mg/dl) CIRURGIA 7o dia 90o dia sacrifício 1 9 121 29 2 38 15 3 17 14 20 4 11 8 8 5 21 12 25 6 9 7 23 13 28 19 8 13 10 32 10 9 22 8 10 11 3 24 17 11 15 5 6 16 12 10 6 23 11 13 22 37 24 14 14 17 5 32 24 15 15 7 23 11 16 23 20 14 21 17 68 17 17 28 14 118 Anexos 7o dia 90o dia GAMA GT (U/L) CIRURGIA sacrifício 1 37 46 2 55 82 82 3 67 127 134 4 32 44 43 5 37 43 26 6 39 7 49 47 16 18 8 66 53 59 51 9 52 45 10 64 47 60 46 11 50 44 57 48 12 35 32 32 33 13 52 38 42 47 14 53 50 51 15 72 54 76 16 23 39 17 71 53 44 69 49 35 78